《Ecology and Evolution》：Pattern of Detections Across Multiple Environmental Messenger RNAs (e-mRNAs) in Stressor-Exposed Zebrafish (Danio rerio)
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本文探讨了利用环境信使RNA（e-mRNA）作为新型环境示踪剂的潜力，通过研究暴露于全氟辛烷磺酸（PFOS）的斑马鱼（Danio rerio）释放的特定e-mRNA（涉及PPAR通路相关基因）在水体中的衰减动态。研究发现，尽管PFOS暴露未引起e-mRNA浓度的显著变化，但所有目标e-mRNA在鱼体移除后3小时内检测率急剧下降，至72小时几乎无法检出，表明e-mRNA可指示生物近期存在。研究强调了目标基因选择（如组织来源）对e-mRNA作为非侵入式环境胁迫监测工具成功应用的关键性。
引言
环境RNA（eRNA）作为一种新兴的环境监测工具，正展现出超越环境DNA（eDNA）的潜力。eDNA主要用于物种检测，而eRNA，特别是环境信使RNA（e-mRNA），不仅能提供更狭窄的生物存在时间窗口（因其更快的信号衰减速率），还可能通过检测基因组对环境胁迫因子的响应，揭示生物的健康状况。本研究旨在探索e-mRNA作为动物种群受胁迫示踪剂的可能性，重点关注目标生物存在至近期存在期间e-mRNA基因检测的衰减动态。
材料与方法
以斑马鱼（Danio rerio）为模型生物，将其暴露于环境相关浓度（100 μg/L）的全氟辛烷磺酸（PFOS）中21天。在暴露结束移走鱼体后，于9个时间点（0至72小时）收集水样，提取总eRNA。通过逆转录实时定量PCR（RT-qPCR）检测7个已知的PFOS毒性分子靶点（涉及PPAR通路）的e-mRNA以及3个内参基因（acta1b, b2m, rpl13a）的表达。采用严格的质控步骤确保RT-qPCR数据的可靠性，并利用ΔΔCT方法进行相对定量分析，以rpl13a作为内参基因进行标准化。
结果
水体和鱼体组织化学分析证实了PFOS在暴露组中的预期浓度（水体平均84.5 μg/L，鱼体37,200 ± 16,700 μg/kg）。然而，PFOS暴露并未引起所选PPAR通路相关e-mRNA靶标浓度与对照组相比的显著差异。总eRNA的量和质量随时间推移而下降，但在鱼体移除后72小时仍可检测。所有e-mRNA的检测率在鱼体移除后3小时显著下降，大多数在72小时时已无法检测。在PPAR相关靶基因中，acox1、fabp2和mmp9的e-mRNAs在鱼体移除后的水样中可检测时间最长。值得注意的是，总eRNA质量（以RNA完整性指数RIN衡量）的显著下降晚于e-mRNA检测率的下降，表明e-mRNA比环境核糖体RNA（e-rRNA）降解更快。
讨论
关于e-mRNA衰减的观察
本研究未能观察到PFOS暴露导致e-mRNA浓度发生可检测的变化，但成功追踪了这些e-mRNA靶标随时间的衰减模式。e-mRNA信号在3小时后急剧衰减的特性，对于建立目标生物存在的时间线具有指示意义。e-mRNA比e-rRNA降解更快的现象也值得注意。未来应用e-mRNA作为胁迫证据时，需考虑胁迫相关基因表达变化的器官或组织是否也是eRNA的可能来源（如排泄物、体表黏液等）。本研究所选基因（PPAR通路相关）主要在肝脏、肾脏等内脏器官表达，这些器官可能不是eRNA信号的主要贡献者，这或许是未观察到胁迫效应的重要原因。初步试验也表明，并非所有在组织中表达的mRNA都能在eRNA样本中成功扩增。采用鸟枪法RNA测序（RNAseq）等先进分子工具对水样中的e-mRNA进行广泛扫描，有助于识别在环境基质中可靠存在且能指示胁迫暴露的靶标e-mRNA。
如何对待e-mRNA数据
鉴于e-mRNA（类似eDNA）通常处于检测限附近且定量关系复杂，传统的基于拷贝数fold change的分析方法可能不适用。研究提出了两种潜在的替代评估策略：
- 1.
基于检测频率的阈值法：比较内参基因和目标基因在对照组和胁迫组的检测频率（如阳性qPCR扩增比例）。设定阈值，例如，在胁迫下，目标基因检测频率显著低于内参基因可能表明基因下调。设定最低内参基因检测率标准可确保水样有足够的eRNA完整性和浓度。
- 2.
基于技术重复的半定量指数法：计算同一eRNA样本中，目标e-mRNA与内参基因在多个技术重复中的阳性扩增比例（如均值或中位数）的比值。比较不同位点的该指数值可能提示胁迫是否存在。这种方法需要足够的技术重复数以减少随机误差。
结论
本研究证实了特定e-mRNA靶标在水环境中的可检测性及其快速的衰减动力学，强调了其作为生物近期存在指示剂的潜力。虽然未能在本实验条件下检测到PFOS暴露引起的特异性e-mRNA变化，但这凸显了目标基因选择的重要性——那些在胁迫下发生表达变化且其转录本能有效释放到环境中的基因是关键。随着方法学的进步和最佳实践的完善，e-mRNA有潜力发展成为一项强大的、非侵入性的环境胁迫监测工具，实现对污染物存在及其生物影响的同步监测。
