《Environmental Microbiology Reports》：A Novel Link Between Electron Transport Chain Modulation and mcl-PHA Production in Pseudomonas aeruginosa 5300 Using Azide as a Modulator
摘要
中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-PHA)是一类由少数细菌产生的弹性可生物降解生物塑料。其大规模生产受到细菌菌株产量低以及培养基中长期营养限制导致生物量减少的限制。本研究显示，铜绿假单胞菌MCC 5300在含有油酸的胰蛋白酶大豆肉汤培养基中生长24小时，可产生约占细胞干重(CDW) 39.4%的mcl-PHA共聚物。在叠氮化物存在下，PHA含量提高至CDW的66.4%。在如此短的时间内，在营养丰富的条件下生产mcl-PHA此前未有报道。叠氮化物的应用增强了细菌中的mcl-PHA生产。油酸将电子传递链(ETC)从细胞色素c库转向泛醌库。叠氮化物对bo3-氧化酶的抑制增加了流向bd-氧化酶的电子通量，以维持氧化磷酸化的质子梯度，导致细胞内还原型氧化还原辅因子水平耗竭。细菌中mcl-PHA积累的增加补偿了还原型氧化还原辅因子的损失，从而维持了细胞氧化还原稳态。因此，该研究揭示了ETC与mcl-PHA生产之间的新联系。
1 引言
石油基塑料的广泛使用因其不可生物降解性和毒性而对各种生态系统造成了严重的负面影响。尽管这些不可生物降解的塑料长期对环境的影响是灾难性的，但由于其应用广泛，减少对其依赖十分困难。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由细菌产生的生物基可生物降解塑料，是石油基塑料的替代品。PHA是细菌在生理胁迫和营养缺乏条件下作为细胞内包涵体合成的(R)-3-羟基链烷酸的聚酯。这些生物聚合物在胁迫条件下作为细菌细胞的能量储备，当在含有过量碳源和限制氮、氧、磷和镁等必需营养素的培养基中培养时会产生。
PHA根据其单体中的碳原子数进行分类。它们是具有3-5个碳原子的短链长度(scl) PHA、具有6-14个碳原子的中链长度(mcl) PHA和具有超过14个碳原子的长链长度(lcl) PHA。PHA聚合物可以是由单一单体组成的均聚物，也可以是具有多种单体的共聚物。mcl-PHA由少数细菌合成，例如假单胞菌属和伯克霍尔德菌属，主要通过脂肪酸β-氧化或从头脂肪酸合成。这些聚合物具有独特的特性，如结晶度降低、高拉伸强度、低熔点和玻璃化转变温度、压电性和弹性体性质，使其适用于工业和生物医学应用。
细菌呼吸通过一系列称为呼吸复合物的酶进行，这些酶嵌入质膜中，形成电子传递链(ETC)。来自不同途径的还原型氧化还原辅因子，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)，将电子提供给ETC。这些电子在呼吸复合物之间顺序转移，最终将其转移至氧分子，导致还原成水。末端氧化酶是一种减少氧气并终止ETC的呼吸复合物。这些氧化酶是促进氧化还原反应的细胞色素复合物。通过这些复合物的电子转移所驱动的能量用于将质子从细菌细胞质泵送到周质，产生跨膜质子梯度。质子回流至细胞质的动能驱动ATP合酶通过氧化磷酸化产生ATP作为细胞能量。氧气限制是诱导细菌产生PHA的胁迫因素之一。因此，末端氧化酶活性、ETC和PHA生产之间可能存在联系。
铜绿假单胞菌利用分支的ETC，在有氧生长期间以细胞色素c氧化酶或泛醌氧化酶终止。该菌有两种C型(cbb3-1和cbb3-2氧化酶)和A型(aa3-氧化酶)细胞色素c氧化酶的同工酶，以及两种泛醌氧化酶(bo3和bd氧化酶)。细胞色素c氧化酶从细胞色素c库接收电子，而泛醌氧化酶从泛醌库接收电子，细菌根据环境条件在这些电子供体之间切换。由于存在多种末端氧化酶和PHA生产能力，本研究探讨了铜绿假单胞菌MCC 5300中末端氧化酶活性与PHA生产之间的联系。该研究旨在通过使用叠氮离子(N3?)抑制细菌中特定的末端氧化酶活性来诱导胁迫，并增强营养丰富培养基条件下的PHA生产。
2 材料与方法
2.1 细菌生长与PHA生产
2.1.1 细菌接种物制备
使用先前从油厂废水中分离并鉴定为铜绿假单胞菌MCC 5300的细菌培养物进行研究。
2.1.2 PHA生产培养基制备和细菌生长
按照制造商的说明制备胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基，并加入38 mM油酸作为额外碳源。使用高压灭菌器对培养基进行灭菌。在接种前，从储备溶液(65 mg/mL)中将叠氮化钠添加到培养基中，以达到适当的最终浓度。
2.2 细菌生长分析
将细菌培养物在30°C、170 rpm下培养，并使用分光光度计每4小时监测一次在620 nm波长处的光密度。
2.3 生物量估算
在固定间隔收获细菌培养物，离心获得细胞沉淀，洗涤后通过重量法估算生物量。
2.4 PHA的提取和定量估算
使用次氯酸钠-氯仿分散法从细菌生物量中提取PHA。获得的PHA薄膜用正己烷洗涤以去除残留的脂质和脂肪酸。通过重量法估算PHA。
2.5 细胞色素c氧化酶活性估算
将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，通过添加N,N,N',N'-四甲基对苯二胺(TMPD)溶液并测量610 nm处吸光度的变化来估算细胞色素c氧化酶(CcO)活性。
2.6 细胞质NAD(P)H的定量
洗涤细胞沉淀并重悬于Tris-HCl缓冲液中，通过超声破碎细胞，离心后使用荧光法在340 nm激发、440 nm发射下定量细胞质组分中的还原型氧化还原辅因子(NADH和NADPH)。
2.7 残留油酸估算
将细菌培养上清液与等体积的异辛烷混合以提取油酸。通过形成异辛烷中的油酸铜皂，使用分光光度法量化残留油酸。
2.8 使用FTIR和质子NMR光谱表征PHA
使用Shimadzu FTIR基塑料分析仪直接分析5 mg PHA，获得400–5000 cm?1波数范围的红外光谱。对于质子NMR光谱，将5 mg PHA溶解于1 mL氘代氯仿中，并使用Bruker Ascend 400 MHz NMR光谱仪进行分析。
2.9 统计分析
实验进行三次重复(n=3)，并绘制为三次独立试验的平均值，误差条表示标准偏差。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验在含有油酸的TSB(TSBOA)中叠氮化物抑制期间细菌PHA生产的统计显著性，然后进行Dunnett多重比较事后分析，以发现与对照相比显著的PHA产量。
3 结果与讨论
3.1 在不同叠氮化钠浓度的TSB培养基中培养铜绿假单胞菌MCC 5300
3.1.1 生长和PHA生产
铜绿假单胞菌MCC 5300在含有0.1、0.5和1 mM叠氮化钠的TSB培养基中培养，并以不含叠氮化钠的TSB作为对照。选择低于最小抑制浓度3 mM的浓度范围进行研究。在0.1和0.5 mM叠氮化钠浓度下观察到生物量分别为2.036和2.061 g/L，与对照(2.155 g/L)相似，但浓度增加至1 mM导致生物量减少1.36倍，为1.575 g/L。在所有条件下，在48和72小时孵育时，生物量均显著下降。与较低浓度和对照相比，1 mM叠氮化钠浓度下的生物量在所有时间点都保持较低水平。
在0.1、0.5和1 mM叠氮化钠浓度下，PHA产量分别约为0.771、0.872和0.729 g/L，而对照中细菌的PHA产量为0.749 g/L。在24小时孵育时，叠氮化钠浓度不同，PHA产量没有显著变化，且产量与对照相似。因此，叠氮化物的存在在24小时孵育时并未引起PHA产量的变化。孵育时间延长至48和72小时，在所有生长条件下PHA产量均显著降低。这是由于PHA解聚酶将PHA聚合物细胞内降解为(R)-3-羟基链烷酸单体，在动员后产生能量以维持细菌生长。
3.1.2 CcO活性
铜绿假单胞菌MCC 5300培养物在0.1、0.5和1 mM叠氮化钠浓度下显示出初始CcO活性分别为35.8、36.7和37.2 μM/min，与对照(38.2 μM/min)相似。在孵育2小时时，0.1和0.5 mM叠氮化钠浓度导致CcO活性分别为31.7和35.9 μM/min，与对照(30.4 μM/min)相似，但浓度增加至1 mM导致活性显著降低至21 μM/min。在24小时孵育时，在1 mM浓度下观察到活性降低约1.6倍，为15.7 μM/min，而对照活性为25.5 μM/min。0.1和0.5 mM的低浓度未引起活性的显著变化。在不同叠氮化钠浓度下，48小时生长时的CcO活性与对照相似，并且直至72小时保持不变。
对脱氮副球菌的研究表明，叠氮离子是细胞色素c氧化酶的有效抑制剂，其协调结合到血红素a3铁和CuB铜原子活性位点，形成原子间分子桥并破坏酶活性。在恶臭假单胞菌F1上进行的研究显示了叠氮化物对细胞色素c氧化酶的类似效应并抑制了有氧生长。在本对铜绿假单胞菌MCC 5300的研究中，叠氮化物抑制CcO活性并未引起PHA产量的任何变化，并且随着叠氮化物浓度的增加，PHA产量保持恒定。叠氮化钠浓度增加至0.5 mM未引起CcO活性或生物量的任何变化，但1 mM浓度由于叠氮化物抑制导致CcO活性降低，引起生物量减少。
3.2 在含有油酸的不同叠氮化钠浓度的TSB培养基中培养铜绿假单胞菌MCC 5300
3.2.1 生长和PHA生产
在含有油酸作为碳源和0.1、0.5及1 mM叠氮化钠的TSB培养基中分析铜绿假单胞菌MCC 5300的生长和PHA生产，并以仅含油酸的TSB培养基作为对照。与不含油酸的TSB培养基相比，TSB培养基中油酸的存在导致所有生长条件下的生物量增加。生物量增加表明细菌细胞有效利用油酸进行生长。细菌在24小时孵育时，在0.1、0.5和1 mM叠氮化钠浓度下生长至生物量分别为3.161、3.187和3.043 g/L，与对照(3.335 g/L)相似。生物量在不同叠氮化钠浓度下保持恒定，并且在1 mM浓度下未像在不含油酸的TSB培养基中那样出现减少。在所有浓度下，48小时孵育时生物量几乎保持恒定，0.1、0.5和1 mM浓度下的生物量分别为3.079、3.491和3.577 g/L，与对照(3.28 g/L)相似。在72小时孵育后，在0.1、0.5和1 mM叠氮化钠浓度下观察到生物量增加，分别约为3.901、3.912和4.044 g/L。与在不含油酸条件下观察到的生物量减少相比，在油酸和叠氮化钠存在下，连续时间点的生物量增加。
培养基中0.1 mM叠氮化钠浓度产生的PHA产量约为1.319 g/L，PHA含量为CDW的41.7%，与对照(PHA产量1.316 g/L，PHA含量39.4% CDW)在24小时孵育时相似。叠氮化钠浓度增加至0.5 mM导致PHA产量增加1.27倍，达到1.677 g/L，PHA含量为CDW的52.6%，与24小时时的对照相比。此外，浓度增加至1 mM将PHA生产增强高达1.53倍，PHA产量为2.021 g/L，PHA含量为CDW的66.4%，与24小时时的对照相比。对照和测试样品的单因素方差分析显示，叠氮化钠浓度的增加显著增加了PHA生产，p值为0.0012 (p < 0.05)。使用Dunnett多重比较检验的进一步分析表明，0.5和1 mM叠氮化钠浓度在24小时生长时导致PHA产量显著增加，p值分别为0.046和0.0011。0.1 mM浓度未引起PHA产量的显著差异，p值为0.999，大于0.05。在48和72小时孵育时，所有生长条件下均观察到PHA逐渐减少。在0.1和0.5 mM叠氮化钠浓度下，PHA产量分别达到0.561和0.553 g/L，与对照(PHA产量0.515 g/L)相似，但浓度增加至1 mM导致略高的PHA产量，约为0.9 g/L。进一步孵育至72小时，在0.1、0.5和1 mM叠氮化钠浓度下，PHA产量分别约为0.492、0.671和0.856 g/L，而对照PHA产量为0.237 g/L。TSBOA中叠氮化钠浓度的增加提高了细菌中的PHA产量。与不含油酸的培养基相比，油酸存在下PHA产量增强表明铜绿假单胞菌MCC 5300利用油酸生产PHA，随后添加叠氮化钠在培养基中诱导胁迫，导致油酸代谢物转向PHA生产，从而增加了体积PHA产量。PHA被细菌细胞降解和利用用于生长，导致生物量增加和PHA产量在延长时间内减少。另一方面，在不含油酸、含有叠氮化钠的TSB培养基中生长的细菌，由于细菌细胞中PHA较少用于生长和营养，长时间孵育后生物量减少。
在含有癸酸(C10)作为碳源的无机盐培养基(MSM)中培养铜绿假单胞菌PAO1，证明了PHA生产。该菌在营养限制下48小时后达到最大PHA产量，为CDW的9.7%。恶臭假单胞菌Bet001使用油酸(C18)在MSM中长时间培养48小时后产生约CDW 11.4%的PHA。恶臭假单胞菌LS46在非无菌条件下使用辛酸在MSM中24小时后产生CDW 16.5%的PHA。然而，在本涉及铜绿假单胞菌MCC 5300的研究中，在非常短的24小时生长时间内实现了高PHA含量，达CDW的39.4%，相比铜绿假单胞菌PAO1和恶臭假单胞菌Bet001需要48小时。恶臭假单胞菌LS46在24小时时PHA含量达到最大值，但仍比铜绿假单胞菌MCC 5300的PHA含量低2.3倍。铜绿假单胞菌MCC 5300在营养丰富的条件下产生高PHA，与铜绿假单胞菌PAO1、恶臭假单胞菌Bet001和恶臭假单胞菌LS46的营养限制条件形成对比。此外，叠氮离子在24小时生长时将细菌细胞中的PHA含量提高至CDW的66.4%。它超过了恶臭假单胞菌KT2440使用月桂酸(C12)、十三烷酸(C13)和肉豆蔻酸(C14)的钠盐在68小时孵育后产生的PHA含量(分别为CDW的32.07%、22.57%和35.93%)。因此，这是首次报道使用叠氮化物诱导胁迫在营养丰富的培养基中增强细菌PHA生产，且不抑制生长和无营养限制。
细菌中的PHA生产需要营养限制、减少通气和培养基中有限的氧浓度。因此，在这些条件下长时间孵育已成为诱导PHA积累和在细菌中实现最大生产的常规做法，但这显著降低了生物量。由于胁迫条件导致的生物量减少引起PHA产量下降。铜绿假单胞菌MCC 5300在营养丰富的培养基中短时间内高产PHA生产避免了营养限制期间的生物量减少。此外，在低于其生长抑制浓度的叠氮化物下增强PHA产量将允许细菌生长，因为不存在营养限制，并改善工业PHA生产。可以避免长时间氧气限制对细菌生长的负面影响，并且在工业规模上可以降低控制氧浓度的维护成本。
3.2.2 细胞色素c氧化酶活性
铜绿假单胞菌MCC 5300在含有0.1、0.5和1 mM叠氮化钠的TSB中显示出初始CcO活性分别为42.6、43.2和38.6 μM/min，与对照(37.1 μM/min)相似。在孵育2小时时，在0.1、0.5和1 mM叠氮化钠浓度下观察到活性急剧下降，分别约为3.5、2.2和5.7 μM/min。在叠氮化钠存在下CcO活性的降低与对照组相似，后者在2小时孵育时显示较低活性，约为2.1 μM/min。在含有油酸的所有条件下培养的细菌中，在24小时孵育时活性保持较低，在0.5–2.7 μM/min范围内。在整个孵育期间活性保持不变。
培养基中油酸的存在导致铜绿假单胞菌MCC 5300在生长早期阶段(约2小时)细胞色素c氧化酶活性降低。细菌中CcO活性降低之后在24小时孵育时出现高体积PHA产量。向培养基中添加叠氮化物提高了细菌细胞中的PHA产量和PHA含量，且不抑制生长，并且浓度变化未引起CcO活性的任何变化。仅在油酸存在下观察到CcO活性随后下降后PHA产量增加，而在无油酸的培养基中则不存在。
对缺乏bo3-氧化酶的突变恶臭假单胞菌KT2440进行的研究显示，该菌中bd-氧化酶和cbb3-1氧化酶显著上调。这表明假单胞菌属中的末端氧化酶根据培养基中的生长条件进行差异表达。因此，一种末端氧化酶的缺失由另一种补偿，以通过氧化磷酸化产生最佳能量。长链脂肪酸如棕榈酸、亚油酸和油酸已知通过与活性位点相互作用来抑制牛心CcO活性。在球形红杆菌的细胞色素c氧化酶中先前观察到保守的脂肪酸结合位点。然而，关于铜绿假单胞菌中细胞色素c氧化酶的抑制知之甚少。因此，油酸降低CcO活性存在两种不同的可能性。一种可能性是油酸结合到活性位点后直接抑制酶，另一种是通过下调铜绿假单胞菌MCC 5300中细胞色素c氧化酶基因的表达。细胞色素c氧化酶的抑制或下调将ETC从细胞色素c库转向泛醌库，导致泛醌氧化酶活性增加。泛醌氧化酶将有助于跨膜质子梯度形成和通过氧化磷酸化产生能量。因此，在孵育2小时后观察到活性降低，但不影响细菌生长。培养基中的叠氮化物未引起细菌生长和CcO活性的任何变化。
3.3 细菌生长分析
在含有1 mM叠氮化钠(TSBSA)和含有油酸及1 mM叠氮化钠(TSBOASA)的TSB培养基中分析铜绿假单胞菌MCC 5300的细菌生长，仅使用TSB培养基作为对照。选择1 mM的最佳叠氮化钠浓度进行研究，因为细菌在不抑制生长的情况下产生最大PHA产量。TSBSA中的细菌培养物显示出三个不同的生长阶段，与对照组相似。指数期以细菌生长增加直至孵育8小时为标志，在TSBS中观察到稳定期直至培养20小时。在TSBSA中观察到死亡期，以孵育20小时后细菌生长减少为标志。与对照组相比，可以观察到TSBSA中的生长略有减少，这与1 mM叠氮化钠浓度下生物量略有减少相关。
在TSBOA和TSBOASA中的细菌生长高于对照组。与TSBSA和对照相比，在油酸存在下，直至80小时孵育，生长稳步增加。与在含有油酸和1 mM叠氮化钠的TSB培养基中获得的高生物量相关，TSBOASA在72小时时显示出比TSBOA略有增长。
3.4 铜绿假单胞菌MCC 5300中PHA生产期间细胞内还原型氧化还原辅因子和油酸消耗的分析
在含有1 mM叠氮化钠(TSBSA)、TSBOA和含有油酸及1 mM叠氮化钠(TSBOASA)的TSB培养基中培养铜绿假单胞菌MCC 5300，分析细胞内总还原型氧化还原(NADH和NADPH)辅因子水平和残留油酸，并以不含油酸和叠氮化钠的TSB培养基(TSB)作为对照。在所有培养基条件下均观察到油酸的高消耗。TSBOASA中的残留油酸浓度为2.6 μM，与TSBOA(浓度2.5 μM)相似，表明尽管培养基条件变化，油酸消耗率保持不变。与对照(浓度98.7 μM)相比，在TSBSA中观察到还原型氧化还原辅因子浓度增加三倍，浓度为303.7 μM。与对照相比，在TSBOA中观察到还原型氧化还原辅因子减少2.6倍，浓度为37.3 μM，并在TSBOASA中进一步减少至23.8 μM。
一项涉及缺乏编码氰不敏感bd-氧化酶基因的重组铜绿假单胞菌PAO6049的研究表明，该菌在1 mM叠氮化钠存在下无法生长。这是由于叠氮离子结合到铜绿假单胞菌PAO6049中的bo3-氧化酶和其他细胞色素c氧化酶上，但由bd-氧化酶基因组成的野生型细菌显示出丰富的生长。这表明bd-氧化酶在细胞色素c氧化酶抑制下的生长过程中是必需的。对铜绿假单胞菌PAO1中各种末端氧化酶的叠氮化物抑制进行的研究表明，叠氮化物不仅抑制该菌中的细胞色素c氧化酶，还抑制利用泛醌作为电子供体的bo3-氧化酶。这主要是由于bo3-氧化酶与细胞色素c氧化酶的特征相似性，因为它们属于同一超家族的蛋白质，称为血红素-铜氧化酶(HCO)。HCO具有用于氧还原的特征性双核血红素-铜活性位点，而与具有由血红素b和血红素d组成的活性位点的bd-氧化酶形成对比。由于活性位点的相似性，叠氮离子结合并抑制bo3-氧化酶活性。在本研究中，叠氮化物对HCO的抑制导致在不含油酸的叠氮化钠存在下培养基中培养的细菌中还原型氧化还原辅因子水平高出三倍。由于缺乏油酸，PHA积累减少，过量的NADH未以PHA形式储存在细菌中，导致其在细胞质中积累，从而破坏了细胞氧化还原稳态。
来自脂肪酸β-氧化途径的NADH将电子转移至NADH脱氢酶(复合物-I)并被氧化为NAD+。当细菌使用细胞色素c氧化酶时，来自复合物-I的电子通过泛醌分子转移至细胞色素bc1复合物(复合物-III)。泛醌分子还从琥珀酸脱氢酶(复合物-II)和其他膜结合脱氢酶接收电子。来自复合物-III的电子通过细胞色素c分子转移至细胞色素c氧化酶。类似地，当细菌使用泛醌氧化酶时，电子直接从泛醌分子转移至泛醌氧化酶。这些复合物产生的质子梯度被ATP合酶(复合物-IV)利用，产生ATP作为细胞能量。早期研究表明，由细胞色素c氧化酶终止的ETC比泛醌氧化酶产生更多的细胞能量，这主要是由于泵入周质以产生质子梯度的高质子量。在本研究中，油酸诱导的细胞色素c氧化酶减少将电子通量从细胞色素c库转向泛醌库。为了补偿细菌生长所需的细胞能量产生损失，大量电子被转移至泛醌氧化酶，从而增加了泵入周质的质子数量。电子向泛醌氧化酶的高流入导致在油酸存在下细胞内还原型氧化还原辅因子水平降低高达2.6倍，与对照相比。为了防止NADH耗竭，PHA以较高量积累在细菌细胞中，PHA解聚酶降解PHA后，恢复细菌中的NADH和NADPH水平以维持生长。与对照相比，在油酸和叠氮化物存在下，还原型氧化还原辅因子进一步减少约4.1倍。这主要是由于叠氮离子抑制bo3-氧化酶，导致电子向bd-氧化酶高流入。叠氮化物抗性bd-氧化酶的活性升高为了质子泵送和能量生成而快速消耗细胞NADH水平。在HCO的叠氮化物抑制期间，细胞NADH的快速消耗通过细菌中PHA积累的增强得到补偿，使其能够生长并产生高PHA产量。
3.5 使用FTIR光谱表征聚合物
使用FTIR光谱分析铜绿假单胞菌MCC 5300在含有油酸和1 mM叠氮化钠浓度的TSB培养基中产生的聚合物，并以仅含油酸的TSB培养基作为对照，聚羟基丁酸酯-共-戊酸酯(PHBV)共聚物作为标准。聚合物的红外光谱显示出5个代表PHA特征的显著峰。聚合物中在3395–3442 cm?1和1719–1722 cm?1范围内的峰表示羟基(–OH)和羰基(–C=O)的伸缩
