快速分离天然AMPA受体复合物的创新策略及其冷冻电镜结构解析

《Protein Science》：Efficient and rapid isolation of native AMPA receptor complexes for cryo-EM

本文报道了一种高效的天然AMPA受体（nAMPARs）快速分离方法，通过全脑组织直接快速 solubilization（15分钟）结合磁珠免疫亲和纯化技术，将传统12小时的纯化流程缩短至2小时。该方法成功保留了更多瞬时相互作用蛋白复合物，并通过冷冻电镜（cryo-EM）解析出包含半展开ATD层的新型构象及四种不同辅助亚基（TARPγ8、CNIH2/3等）排列模式，为研究神经突触可塑性和受体动态调控机制提供了重要技术平台。

　　

2.1 全脑组织快速solubilization策略的优化

传统nAMPARs分离方法需要先通过超速离心制备粗膜组分，再进行长达数小时的去垢剂solubilization，整个过程耗时约7小时。为提升效率，本研究开发了直接solubilization全脑组织的简化流程（图1b）。通过比较不同去垢剂（digitonin）孵育时间（15分钟至5小时）的solubilization效率，发现15分钟孵育即可达到3小时处理的80%效率，且通过Triton X-100/脱氧胆酸钠二次solubilization证实残留不溶性nAMPARs量无显著差异（图2）。该方法通过低速离心结合过滤替代超速离心，将样本制备时间缩短至30分钟。

2.2 磁珠与蛋白酶切联用的高效免疫亲和纯化

研究采用带有mCherry荧光标签及HRV 3C蛋白酶切位点的anti-GluA2 15F1 Fab（图3），结合抗FLAG磁珠实现快速捕获。与重力层析相比，磁珠分离显著缩短操作时间，且通过高浓度3C蛋白酶（5分钟孵育）实现特异性洗脱。洗脱产物进一步与anti-GluA1 11B8 scFv、anti-GluA3 5B2 Fab孵育标记亚基，最终经荧光检测尺寸排阻色谱（FSEC）纯化（图4）。FSEC轨迹显示，nAMPARs在30分钟内完成纯化，洗脱峰单一且单分散性良好。

2.3 快速分离策略对nAMPAR复合物的保留效果

对比全脑快速solubilization（15分钟）与粗膜长期solubilization（3小时）的纯化效果，发现快速法制备的nAMPARs分子量增加约50 kDa，且产量提高2.6倍（图5a）。质谱分析显示，快速法样本中检测到的总蛋白和肽段数量分别为传统方法的3倍和5倍，除核心亚基（GluA1-A3）外，还保留了更多辅助蛋白如ABHD6、CPT1C、TARP γ8，以及瞬态相互作用蛋白（PSD-95、SAP97、ABHD12、Shisa 9、NSF、AP-2复合物等）（图5b）。这表明快速法能更全面地捕获从内质网组装到突触定位全过程的相互作用蛋白。

2.4 快速纯化nAMPARs的冷冻电镜结构解析

冷冻电镜分析揭示了13种不同的nAMPAR亚基组合（图6a），包括传统方法未观察到的半展开ATD层构象（占颗粒总数17%）。其中三异聚体A1A2A3A2（32%）、二异聚体A1A2A1A2（30%）和A3A2A3A2（17%）为主要类型。半展开构象中，一个ATD二聚体呈现高度柔性，可能与GluA1亚基占据B位有关。TMD层分类鉴定出四种辅助亚基排列模式（图6b）：TMD_2TARPs（B′、D′位为TARP）、TMD_{2TARPs-2CNIHs}（B′、D′位为TARP γ8，A′、C′位为CNIH2/3）、TMD_3TARPs-1CNIH（A′位为CNIH，B′、C′、D′位为TARP）和TMD_4TARPs（四位点均为TARP）。在TMD_{2TARPs-2CNIHs}和TMD_3TARPs-1CNIH的M4与CNIH2/3的TM4螺旋间隙发现疑似SynDIG4的密度，且孔道中心观察到离子或水分子密度。亚基组合分析显示，TMD_{2TARPs-2CNIHs}类别中A1A2A1A2占比最高（38%），与海马nAMPARs偏好一致。

3 讨论

本研究建立的快速分离技术将nAMPARs纯化时间从12小时缩短至2小时，产量提升且能保留更多瞬态相互作用蛋白。冷冻电镜解析的半展开ATD构象及新型辅助亚基排列模式，为理解AMPAR在突触可塑性中的构象动态调控提供了新视角。尽管全脑组织来源的样本存在异质性，但该方法可推广至其他天然膜蛋白复合物的研究，特别是那些与瞬态相互作用伙伴形成的功能组装体。未来结合亚细胞分选或体内交联技术，有望进一步揭示区域特异性AMPAR复合物的精细结构。

4 方法

4.1 15F1 Fab-mCherry-3C-3×FLAG的表达纯化：通过杆状病毒系统在Sf9细胞中表达，经His标签亲和、TEV酶切、FLAG亲和及SEC纯化获得。

4.2 全脑组织solubilization条件筛选：小鼠全脑匀浆后直接加入2% digitonin及15F1 Fab，不同时间点取样经FSEC分析solubilization效率。

4.3 快速纯化流程：solubilization supernatant与抗FLAG磁珠孵育10分钟，洗涤后经3C蛋白酶切（5分钟）洗脱，再与11B8 scFv、5B2 Fab孵育后FSEC纯化。

4.4 质谱分析：FSEC峰前段样本经SDS尿素裂解、酶切、液相色谱-质谱联用分析，数据库检索使用Comet算法。

4.5 冷冻电镜制样与数据采集：样本吸附于连续碳膜金网，液态乙烷速冻，Titan Krios电镜采集33,133组电影数据。

4.6 数据处理：通过cryoSPARC进行运动校正、CTF估计、颗粒挑选、2D/3D分类，最终获得13种ATD层构象及4种TMD层辅助亚基排列的高分辨率结构。

4.7 模型构建：使用UCSF Chimera和Coot进行刚性拟合和手动调整，Phenix进行实空间优化，模型中包含有序脂质分子及孔道离子密度。