在血管病理学中，用于固定于福尔马林、包埋于石蜡组织中的内皮糖萼成像的实用方法

《Microvascular Research》：Practical method for endothelial glycocalyx imaging in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues in vascular pathology

血管内皮糖萼（eGCX）可视化与病理分析新方法：开发并验证了一种适用于FFPE组织切片的eGCX可视化及半定量分析技术，结合ALB染色、PAM银增强和低真空SEM，实现多血管床（脑、脉络丛、视网膜）的高效筛查，检测病理改变（如视网膜静脉阻塞中的eGCX缺失），为临床转化提供新方法。

　　

森康辅|富田宏之|久野雅志|飯田智宏|山北嘉彦|高田千尋|栗山愛香|中村慎介|島澤雅光|广瀬敏光|坂木雅明|坂木真由|杉田英隆|杉江茂之|岡田英志|原明

日本岐阜大学医学研究生院肿瘤病理学系

摘要

内皮糖萼（eGCX）是一层富含碳水化合物的精细结构，覆盖在血管内皮上，对维持血管稳态起着关键作用，调控着血管通透性、血栓形成和炎症反应。尽管其重要性不言而喻，但由于其脆弱的结构在常规固定过程中容易破坏，因此对其形态的评估在技术上仍具有挑战性。现有的可视化方法需要复杂的样本处理、昂贵的设备以及新鲜的组织样本，严重限制了其应用范围和临床可行性。本文提出了一种实用的方法，利用经过Alcian blue固定和石蜡包埋（FFPE）处理的组织切片，并结合银染色和低真空扫描电子显微镜技术，实现对eGCX的可视化及半定量分析。该方法能够清晰地观察到多种血管类型的eGCX，包括脑实质血管、脉络丛有孔毛细血管和视网膜血管，并能生成可用于不同FFPE切片间比较的厚度指数。实验结果显示，该方法在检测病理变化方面具有高灵敏度，例如在视网膜静脉阻塞模型中，eGCX几乎完全丧失，伴随厚度显著减少和凝集素荧光强度的降低。最后，该技术成功应用于经过即时Alcian blue固定处理的人类结直肠手术标本，实现了FFPE临床切片中血管eGCX的可视化。总体而言，这些发现为基于FFPE的广泛视野eGCX成像和病理学分析提供了可行的方法。

引言

糖萼（GCX）是由上皮细胞、细菌及其他类型细胞产生的糖蛋白和多糖组成的层状结构，不仅存在于血管内皮和胃肠道表面，也存在于癌细胞及细菌表面。其存在最早由Luft（1966年）和Rambourg等人（1966年）通过电子显微镜观察到。我们的研究重点在于血管内皮糖萼（eGCX），这是一种覆盖在血管内皮细胞管腔表面的薄而高度水化的糖层，主要由蛋白聚糖、糖胺聚糖和糖蛋白构成。尽管厚度仅有50–500纳米，eGCX在维持血管稳态方面发挥着至关重要的多方面作用，包括调节血管通透性、抑制血小板聚集和白细胞黏附、促进一氧化氮生成以及作为流体剪切应力的机械传感器（Chelazzi等人，2015年）。eGCX的结构和功能异常与多种血管疾病相关，如败血症、慢性肾病、急性呼吸窘迫综合征、缺血-再灌注损伤，甚至癌症进展和治疗抵抗性。值得注意的是，脑毛细血管中的eGCX比心脏或肺部的更为致密和厚实，具有更强的抗损伤能力，对维持大脑特异性稳态至关重要（Ando等人，2018年；Shi等人，2025年）。因此，准确评估eGCX的结构和功能对于阐明疾病机制及开发新的诊断和治疗策略至关重要。然而，由于其脆弱且不稳定的特性，可视化及评估其形态在技术上仍面临挑战。

eGCX主要由富含水分的多糖组成，在常规化学固定和脱水过程中容易收缩或破坏。此外，其低电子密度要求使用特殊染色方法进行显微镜观察（Shea，1971年）。透射电子显微镜（TEM）长期以来一直是唯一能够以纳米级分辨率观察eGCX超微结构的方法，但该方法存在视野狭窄、样本处理复杂且易产生伪影等局限性。扫描电子显微镜（SEM）虽然能提供更广泛的三维（3D）表面成像，但通常在没有特殊技术（如冷冻断裂或镧染色）的情况下会导致eGCX几乎完全丧失（Okada等人，2017年；Mori等人，2024年）。传统电子显微镜方法的局限性限制了eGCX的研究进展，阻碍了对其在临床应用中的全面理解。

除了传统电子显微镜外，还开发了几种用于脑组织中观尺度成像的技术。磁共振显微镜可提供具有软组织对比度的体积成像，但全脑的各向同性分辨率通常仅在几十微米范围内（例如离体样本为15–25微米），不足以观察内皮超微结构或亚微米级的eGCX（Sato等人，2018年；Johnson等人，2023年）。同步辐射X射线断层扫描和相位对比断层扫描技术可实现小鼠全脑的微米级各向同性分辨率（Rodgers等人，2021年）。高端的同步辐射X射线纳米断层扫描/叠层断层扫描技术可在小体积样本中达到超微结构分辨率，但技术要求较高（Bosch等人，2025年）。值得注意的是，断层扫描技术还能实现脉络丛的细胞级三维可视化，并能定量测量上皮层厚度，但由于需要使用同步辐射设施，其应用范围受到限制（Tanner等人，2025年）。最新研究还表明，活体相位对比断层扫描可能实现小鼠全脑的微米级体素成像（Girona Alarcón等人，2025年）。尽管取得了这些进展，仍迫切需要一种适用于FFPE样本的、易于操作的eGCX成像和半定量分析方法（表1）。

为克服这些挑战，我们开发了一种结合Alcian blue（ALB）选择性染色、过碘酸-甲苯胺（PAM）银染色和低真空扫描电子显微镜（LVSEM）的成像方法，实现了FFPE组织切片中eGCX分布和数量的便捷、大面积、半定量评估。

实验方法

体内动物实验

从Charles River Japan（日本神奈川县）获取了10周大的雄性C57BL6/J小鼠（共3只），并在实验开始前让它们适应环境1周。小鼠在22±1°C的正常光照/黑暗周期下饲养，喂食普通饲料（CE-2；CLEA Japan, Inc., 东京，日本），并使用高压灭菌自来水。所有动物实验均遵循岐阜大学国际动物护理和使用委员会的规定（编号2021–108, 2022–039）。

FFPE小鼠脑标本中血管eGCX的LVSEM可视化

在对小鼠大脑进行灌注固定并加入ALB后，观察了FFPE切片的H&E染色图像。结果显示，未添加ALB的组别血管腔未发生染色（图1A），而添加ALB的组别血管腔呈现蓝色染色，证实了ALB的有效递送（图1B）。后续的银染色（PAM染色）和LVSEM分析显示，未添加ALB的对照组样本血管内皮表面没有特异性银沉积。

讨论

本研究建立了一种基于FFPE的成像流程，结合了ALB灌注固定、PAM银染色和LVSEM技术，实现了eGCX的可视化及半定量评估。与需要特殊处理且视野狭窄的传统TEM相比，LVSEM能够在常规石蜡包埋组织切片上进行快速、大面积的筛查，并生成基于厚度的可重复“厚度指数”。

结论

我们开发了一种适用于FFPE样本的LVSEM流程，用于广泛区域的eGCX半定量分析。该方法可整合到常规病理学流程中，用于微血管研究的转化应用。

术语表

Alcian blue (AB)
一种能与糖萼结合的蓝色染料，使其可见
血脑屏障
大脑血管内的一种保护性层，控制物质进入大脑
相关光电子显微镜
结合标准显微镜图像和同一位置的电子显微镜图像的方法
内皮糖萼 (eGCX)
所有血管内表面的精细糖基涂层
有孔内皮
具有微小孔隙的血管细胞

CRediT作者贡献声明

森康辅：撰写原始稿、可视化、方法学设计、实验设计、概念构建。富田宏之：撰写原始稿、可视化、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念构建。久野雅志：实验设计。饭田智宏：实验设计。山北嘉彦：实验设计。高田千尋：实验设计。栗山愛香：实验设计。中村慎介：实验设计。岛泽雅光：实验设计。岛泽雅光：

资助

本研究得到了JSPS KAKENHI（资助编号JP20K0758723、JP23H03326、JP23K08005）、JST FOREST计划（资助编号JPMJFR220W、JPMJFR200N）、AMED罕见/难治性疾病实用研究项目（资助编号JP24ek0109702）以及AMED项目（资助编号JP25ym0126807）的支持。

未引用参考文献

Miyazaki等人，2012年
Nakagawa等人，2014年
Ozone等人，2016年
Taga等人，2023年

利益冲突声明

作者声明以下可能的利益冲突：富田宏之表示获得了岐阜大学的资助，并与岐阜大学存在雇佣关系。其他作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

感谢高桥京子、杉田彩子、户岛泉、常岛礼子及清水正敏在实验中的支持，同时感谢名古屋大学医学研究生院的医学研究工程部门提供的共聚焦激光扫描显微镜和图像分析软件。此外，也感谢Editage（网址：www.editage.com）对本文的英文编辑。