利用CRISPR/Cas9技术敲除OsPLDβ1基因增强水稻抗旱性的分子机制研究

《Plant Physiology and Biochemistry》：CRISPR mediated inactivation of OsPLDβ1 phospholipase enhances drought tolerance by upregulating stress-related genes and antioxidant enzymes in rice

本研究针对水稻抗旱性提升的迫切需求，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了OsPLDβ1基因敲除的水稻突变体。研究发现，OsPLDβ1功能缺失能显著增强水稻的干旱耐受性，其机制涉及活性氧（ROS）清除系统的增强、抗氧化酶活性的上调、水分利用效率的提高以及应激相关基因的表达调控。该研究为通过分子育种培育抗旱水稻新品种提供了重要的基因靶点和理论依据。

　　

随着全球气候变化加剧，干旱已成为制约水稻生产的主要非生物胁迫之一。水稻作为全球半数以上人口的主粮，其生产稳定性直接关系到粮食安全。植物在应对干旱胁迫时，会激活一系列复杂的分子响应机制，其中磷脂酶D（Phospholipase D, PLD）介导的脂质信号通路在感知和传导胁迫信号中扮演着关键角色。PLD能够水解膜磷脂产生磷脂酸（Phosphatidic Acid, PA），后者作为重要的第二信使，参与调控植物的应激反应。水稻基因组中含有多个PLD家族成员，它们的功能存在冗余性和特异性，其中OsPLDβ1的功能尤其在干旱应激响应中尚不清晰。明确OsPLDβ1在水稻抗旱机制中的作用，对于理解植物耐旱机理及作物遗传改良具有重要意义。相关研究成果发表在《Plant Physiology and Biochemistry》上。

为解析OsPLDβ1的功能，研究人员采用了CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在籼稻品种Samba Mahsuri（BPT 5204）中成功获得了OsPLDβ1基因功能缺失的纯合突变体（Ospldβ1-1和Ospldβ1-2）。通过PCR和测序验证了突变体的基因型。在生理水平上，研究通过盆栽干旱处理、离体叶片失水率测定、植株整体蒸腾速率测量、叶绿素含量测定、电解质泄漏率分析、丙二醛（MDA）含量检测以及抗氧化酶活性测定等一系列实验，系统评估了突变体的抗旱表型。在分子机制层面，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析了干旱胁迫下应激相关基因的表达模式，并通过组织化学染色（DAB和NBT染色）观察了活性氧的积累情况。

3.1. CRISPR/Cas9介导的OsPLDβ1基因突变

研究人员利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑OsPLDβ1基因的第一个外显子，获得了两个独立的纯合突变体株系（Ospldβ1-1和Ospldβ1-2）。测序结果显示，Ospldβ1-1发生了1个碱基（C）的插入，而Ospldβ1-2发生了1个碱基（C）的缺失，这两种突变均导致阅读框移位并产生提前终止密码子，从而成功敲除了OsPLDβ1的功能。qRT-PCR分析证实，突变体中OsPLDβ1的转录本水平显著降低。

3.2. OsPLDβ1敲除提高抗旱性及细胞膜稳定性

在干旱胁迫下，Ospldβ1突变体相比野生型（WT）表现出更强的存活率（89-93% vs 6%）。突变体的叶片相对含水量（RWC）更高，电解质泄漏率和MDA含量更低，表明其细胞膜受损程度更轻。同时，突变体在干旱下能保持更高的叶绿素含量。

3.3. 通过离体叶片和整株植物蒸腾分析评估水分状况

离体叶片失水实验表明，Ospldβ1突变体的失水速率显著低于WT。整株植物蒸腾测量进一步证实，突变体在日常蒸腾中水分损失减少10.4%至13.9%。红外热成像显示，在干旱条件下，突变体的冠层温度低于WT，表明其通过蒸腾冷却保持了较好的水分状态。

3.4. OsPLDβ1负调控干旱胁迫下的活性氧清除系统

DAB和NBT组织化学染色显示，干旱胁迫下Ospldβ1突变体中过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂^.-）的积累显著少于WT。生化测定发现，突变体中超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）的活性更高，与其相关基因（如OsAPX8, OsCAT-a）的上调表达一致。

3.5. OsPLDβ1敲除显著改善营养生长阶段的渗透胁迫耐受性

在甘露醇模拟的渗透胁迫下，Ospldβ1突变体在种子萌发和幼苗生长阶段均表现出比WT更强的耐受性。突变体的主根更长，根数更多，存活率更高，且电解质泄漏率更低。根部组织化学染色也显示突变体ROS积累更少。

3.6. OsPLDβ1功能缺失增强对甲基紫精诱导的光氧化损伤的耐受性

用甲基紫精（Methyl Viologen, MV）处理离体叶片诱导光氧化胁迫后，Ospldβ1突变体的叶绿素降解程度显著低于WT，且H₂O₂和O₂^.-积累更少，表明其抗氧化损伤能力更强。

3.7. OsPLDβ1功能缺失增加水稻对外源ABA的敏感性

在含有外源脱落酸（ABA）的培养基上，Ospldβ1突变体种子的萌发率、幼苗鲜重、根长和苗高均受到比WT更显著的抑制，表明突变体对ABA的敏感性增加。这提示OsPLDβ1可能负调控ABA信号通路。

3.8. 水稻中PLDβ1功能缺失调节应激响应基因和其他PLD亚型的转录调控

qRT-PCR分析发现，在Ospldβ1突变体中，其他PLD家族成员（如OsPLDα1, OsPLDα3, OsPLDδ1, OsPLDδ2, OsPLDδ3）以及多种应激响应基因（如bZIP68, ONAC7, TPP1, LEA7, OsNCED1, OsNCED2, CCR10, Dirigent, P5CS, DREB1A, OsAPX8, OsCAT-a）的表达水平在干旱胁迫下均显著上调。这表明OsPLDβ1的缺失可能激活了一个更广泛的应激防御网络。

本研究通过多角度证据表明，敲除OsPLDβ1能通过多种机制显著增强水稻的抗旱性。在生理层面，突变体通过降低蒸腾速率、提高水分利用效率、维持细胞膜完整性和叶绿素含量来减少干旱造成的损伤。在生化层面，突变体增强了抗氧化酶系统的活性，有效清除了干旱诱导产生的过量ROS，减轻了氧化损伤。在分子层面，OsPLDβ1的缺失可能解除了其对其他PLD亚型（如PLDα1, PLDδ等）或相关应激通路的抑制作用，导致PA信号或其他保护性信号增强，并最终引发一系列应激保护基因（包括抗氧化、渗透调节、ABA合成、木质素合成等相关基因）的上调表达，从而形成了更强大的综合防御体系。特别值得注意的是，突变体对ABA的敏感性增加，暗示OsPLDβ1可能作为一个负调控因子参与ABA信号通路，其缺失使得ABA介导的气孔关闭和应激响应更为迅速有效。该研究不仅首次明确了OsPLDβ1在水稻抗旱中的负向调控作用，为理解PLD家族各成员功能的复杂性和特异性提供了新视角，而且为利用基因编辑技术定向改良水稻抗旱性提供了有应用前景的基因靶点（OsPLDβ1），对于培育节水抗旱的水稻新品种、应对全球气候变化下的粮食安全挑战具有重要的理论和实践意义。