《Sensors and Actuators B: Chemical》：Highly Sensitive Detection of Epithelial Markers on Single Tumor Cell Surface by an Endonuclease-assisted Assay on Superwettable Droplet Microarrays (EASDM)
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CRISPR/Cas12a结合新型G4荧光探针实现低成本高灵敏度分子检测，通过3'端尾序列稳定G4结构并增强切割效率，释放荧光信号，并建立RPA辅助检测体系，灵敏度达16 aM，特异性为单碱基，验证了HBV检测100%与qPCR一致性。
黄娟 | 吴文文 | 陆世月 | 徐媛 | 张红 | 上书 | 杨欣 | 何洪飞 | 王强 | 杨汉锋 | 罗广城
四川省北川医学院附属医院临床实验室；四川省北川医学院实验室医学与转化医学研究中心，中国南充637000
摘要
将CRISPR/Cas12a与成本效益高的探针结合使用对于分子诊断至关重要。然而，经典的荧光团-淬灭剂标记的单链DNA（ssDNA）探针具有较高的生产成本。在此，我们开发了一种新型的无淬灭剂荧光G-四链体（G4）探针，适用于CRISPR/Cas12a，具有出色的成本效益。我们发现FAM荧光团可以被G4有效淬灭，而将3′侧翼序列引入单个FAM标记的G4中会破坏其拓扑结构，从而实现CRISPR/Cas12a的有效切割，释放出被G4淬灭的荧光。与传统关闭型CRISPR/Cas12a/G4系统相比，这种G4辅助CRISPR/Cas12a报告系统（GCR）创新性地实现了成本效益高的开启型信号输出。此外，我们将GCR与先前开发的dNTPαS辅助的RPA结合，建立了RPA/GCR检测方法。该方法具有超灵敏度（高达16 aM）和单碱基分辨能力，HBV DNA检测结果与qPCR结果完全一致（100%一致）。总之，我们开发了一种新型的CRISPR/Cas12a/G4开启型信号输出策略，并建立了一种实用的RPA/GCR检测方法，凸显了其在分子诊断中的巨大潜力。
引言
分子诊断在传染病、遗传疾病和恶性肿瘤[1]、[2]、[3]中发挥着重要作用。作为新兴的尖端分子诊断工具，CRISPR/Cas系统受到了广泛关注并得到了广泛应用[4]、[5]。对于核酸检测，CRISPR/Cas12a可以特异性识别目标DNA并高效非特异性地降解单链DNA（ssDNA），从而将目标DNA识别转化为可检测的信号[5]、[6]、[7]。
基于切割机制，CRISPR/Cas12a通常使用FAM/BHQ双标记的ssDNA来实现开启型信号输出（ssDNA降解后释放被淬灭的荧光）[8]、[9]，或使用G4实现关闭型比色检测（G4降解后消除G4过氧化物酶活性和显色反应）[10]、[11]、[12]。然而，相对昂贵的FAM/BHQ双标记报告系统在储存过程中不稳定，导致淬灭效率降低[13]。G4通过方形Hoogsteen氢键网络形成堆叠的G-四链结构。将G4整合到CRISPR/Cas12a中是一种成本效益高的比色核酸检测方法[14]、[15]。然而，这些方法通常呈现关闭型读数模式[16]、[17]。因此，迫切需要开发低成本、简单且可视化的CRISPR/Cas12a基核酸检测报告系统。
研究表明，核酸碱基具有荧光淬灭效应，其中鸟嘌呤（G）的淬灭效率最高[18]、[19]。G4丰富的独特结构使我们推测它们可以有效淬灭荧光。然而，G4自身的核酸酶抗性对CRISPR/Cas12a介导的切割有显著影响，从而不利于信号生成[20]、[21]、[22]。先前的研究表明，G4的稳定性会随着环或侧翼序列长度的增加而降低[23]。基于这些发现，我们假设向G4中添加侧翼序列可以通过破坏G4结构来提高CRISPR/Cas12a的切割效率。
在此，我们开发了一种新型的G4辅助CRISPR/Cas12a报告系统（GCR），该系统将CRISPR/Cas12a与3′端带有G4的探针结合以实现信号输出。与传统关闭型CRISPR/Cas12a/G4系统[16]、[17]不同，我们的GCR创新性地实现了成本效益高的开启型信号输出。此外，利用先前开发的S-RPA（dNTPαS辅助的RPA）[24]，我们成功建立了RPA/GCR检测方法。该方法具有超灵敏度（高达16 aM）、高特异性（能够区分单碱基），并且实际应用效果良好（与qPCR结果一致率100%），展示了其在分子诊断中的巨大潜力。
材料与试剂
试剂包括DNA寡核苷酸、质粒、gRNA、dNTPs、SYBR Green、丙烯酰胺/甲基丙烯酰胺（29:1）、聚丙烯酰胺、丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、4SGelred核酸染料以及6×、2× DNA上样缓冲液，均购自上海Sangon Biotech（中国上海）。3'-FAM修饰的DNA寡核苷酸购自Hippo Biotechnology（中国浙江）。磷硫酰修饰的dNTPs（dNTPαS）购自Zhong Meng Research Technology（湖北）。
Cas12a对带尾G4的高效切割
根据我们的假设（图1A），线性Poly G和G4能有效淬灭荧光（图S1），但抵抗Cas12a的切割；而带有3′侧翼序列的3′-尾G4既能淬灭荧光又能被Cas12a有效切割。实时分析证实，3′-尾G4（尤其是G42-1）的Cas12a切割效率更高（图1B），且荧光差异最显著（图1C），优于线性Poly G和常规G4。PAGE分析显示（
讨论
CRISPR/Cas12a和G4的组合是比色核酸检测中最常见的策略之一。然而，这种策略通常依赖于CRISPR/Cas12a介导的G4切割来产生关闭型信号输出[16]、[17]。研究表明鸟嘌呤（G）可以有效淬灭荧光[18]、[19]。因此，我们推测富含G的G4可以无需额外淬灭基团即可有效淬灭FAM荧光；Cas12a介导的G4
资助
本工作得到了以下资助：国家自然科学基金（82472386）、四川省自然科学基金（2024NSFSC1546）、四川省卫生健康委员会（23LCYJ038）、南充市科技基金（23JCYJPT0032）、四川省北川医学院附属医院研究基金（2024CX001和2023PTZK016）。
CRediT作者贡献声明
杨欣：验证、方法学设计。上书：研究实施、资金筹集。张红：项目管理、资金筹集。徐媛：研究实施、资金筹集。陆世月：数据可视化、验证。吴文文：研究实施、数据分析。黄娟：初稿撰写、验证、数据管理。罗广城：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集、概念构思。杨汉锋：监督、软件开发、资金筹集。黄娟于2025年获得四川省北川医学院临床实验室诊断硕士学位。她目前在中国绵阳市安州区人民医院临床实验室担任实验室技术员，主要从事新型分子探针和分子诊断技术的研究。
