纳米孔测序技术鉴定香蕉枝孢霉抗药性的概念验证研究及其转录组学分析

《CyTA - Journal of Food》：Nanopore sequencing as a proof of concept for antifungal resistance in Cladosporium cladosporioides from banana

本文首次应用牛津纳米孔测序技术（ONT）对香蕉果皮中分离的枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）进行抗药性分析，发现该菌株可耐受300 ppm抑霉唑（Imazalil），半数抑制浓度（IC50）达180 ppm。通过转录组分析检测到烯醇化酶基因（ENO1/ENO2）表达，提示其可能通过代谢重编程参与应激响应。研究为农业病原真菌抗药性快速监测提供了新技术路径，虽受RNA质量限制，仍展现了ONT在田间实时检测中的潜力。

　　

研究背景与意义

全球果蔬采后损失率在发展中国家可达40%以上，病原真菌是主要诱因。抑霉唑等唑类杀菌剂的广泛使用导致抗药菌株涌现，传统检测方法如PCR和桑格测序存在时效性局限。牛津纳米孔技术（ONT）凭借长读长、实时分析优势，为抗性基因快速筛查提供新方案。

材料与方法

从香蕉果皮分离纯化真菌菌株，通过抑霉唑浓度梯度（15-300 ppm）平板实验筛选抗性菌株。利用ONT进行ITS区域测序鉴定物种，并对高抗性菌株开展直接RNA测序。转录组数据经Trinity拼接、BLASTx注释，通过热图分析基因表达模式。

结果分析

菌株鉴定显示HBAN8为枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），能在300 ppm抑霉唑环境下生长，IC₅₀为180 ppm。RNA测序检出20个转录本，其中烯醇化酶基因ENO1和ENO2显著表达。这些基因参与糖酵解途径，为ERG11介导的麦角固醇合成提供前体，可能与真菌应激适应相关。但测序深度不足与RNA质量缺陷（RIN<6）限制了差异表达分析。

讨论与局限

枝孢霉对抑霉唑的高抗性可能与既往环境胁迫适应有关。烯醇化酶基因虽非直接抗性标记，但可通过调控能量代谢增强真菌适应性。研究受限于R9.4.1测序芯片精度（Q值<20）及基序识别算法版本，未来需优化RNA提取方法、延长测时并使用R10.4芯片提升数据质量。

结论与展望

本研究验证了ONT技术在农业真菌抗药性初步评估中的可行性，枝孢霉中烯醇化酶基因的发现为抗性机制研究提供新线索。将纳米孔测序整合至采后病害监测体系，有望实现抗性菌株早期预警，推动可持续植物保护策略发展。