《Fly》：Detection of Nora virus in infected Drosophila melanogaster heads without evidence of ubiquitous brain infection by smRNA FISH
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本文通过RT-PCR和smRNA FISH技术，探究了果蝇Nora病毒（DmNV）在感染果蝇头部和脑组织中的分布情况。研究发现，虽然能从感染果蝇头部检测到DmNV基因组物质（ORF1），但smRNA FISH检测未在脑组织中发现病毒RNA（ORF4），提示病毒可能通过血淋巴传播而非直接感染神经元。研究验证了smRNA FISH是一种检测RNA病毒的有效方法，并观察到DmNV主要感染肠道上皮细胞，且感染模式存在个体差异。该研究为理解DmNV的组织嗜性提供了新见解，并展示了smRNA FISH在昆虫病毒研究中的应用价值。
引言
果蝇Nora病毒（DmNV）是一种正链单股RNA病毒，在遗传和结构上与细小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的病毒相似，后者包括脊髓灰质炎病毒等对人类健康有重要影响的病毒。尽管DmNV最初被认为是无症状感染，但后续研究发现它可能导致果蝇后代数量减少、细菌负荷增加、运动功能受损和睡眠时间增加等表型。由于DmNV与具有神经嗜性的细小核糖核酸病毒相似，本研究旨在探究DmNV是否能进入果蝇头部并感染脑组织。先前的研究通过相对表达量RT-PCR在果蝇头部检测到的病毒含量可忽略不计，但检测到了DmNV特异的小干扰RNA（siRNA），这提示头部可能存在针对病毒的免疫反应或病毒DNA逆转录途径。因此，本研究通过更灵敏的分子技术进一步探索DmNV在果蝇头部和脑组织中的分布。
方法
研究使用Witi RelE23果蝇品系，该品系携带DmNV且为白眼品系，有利于荧光显微镜观察。通过口服暴露于病毒建立感染模型，并设立未感染对照组。分别从感染和未感染果蝇的头部及身体分离RNA，利用针对DmNV开放阅读框1（ORF1）的引物进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），并以α微管蛋白（alpha tubulin）作为内参基因。为检测病毒在组织中的精确定位，研究设计了针对DmNV ORF4的小分子RNA荧光原位杂交（smRNA FISH）探针，并利用BLASTn工具筛选以确保探针特异性，避免与非靶标mRNA结合。对感染和未感染果蝇的脑组织和肠道组织进行解剖、固定，然后进行smRNA FISH染色。最后，使用共聚焦显微镜和倒置荧光显微镜对样本进行成像，并通过FIJI软件进行图像处理和分析。
结果
DmNV核酸存在于感染果蝇的头部
RT-PCR结果显示，从感染DmNV的果蝇头部RNA中成功扩增出约790 bp的DmNV ORF1目标条带，而在未感染对照组中未检测到该条带。这表明DmNV的遗传物质确实存在于感染果蝇的头部。
smRNA FISH有效靶向DmNV ORF4
为验证smRNA FISH方法的有效性，研究首先在果蝇肠道组织中进行测试。共聚焦显微镜图像显示，在感染DmNV的果蝇肠道中出现了清晰、强烈的smRNA FISH信号，而在未感染对照组中几乎观察不到背景噪音，证明该方法能有效、特异地检测DmNV RNA。
脑组织中未发现广泛DmNV神经嗜性的证据
对从DmNV感染果蝇解剖的完整脑组织进行smRNA FISH检测，靶向DmNV ORF4。在所有检测的脑组织标本中（至少20个），均未发现任何表明DmNV ORF4存在的信号。与此同时，所有脑组织中的细胞核均能被DAPI染色清晰显示。
通过smRNA FISH检测技术进一步表征DmNV肠道感染
smRNA FISH检测显示，DmNV感染在果蝇肠道中表现出个体差异，仅在约三分之一的检测样本中观察到明显的感染信号。病毒感染主要局限于肠上皮细胞（根据其大细胞核识别），偶尔在可能为肠道干细胞（ISC）的小核细胞中观察到感染。研究还注意到，受感染的肠上皮细胞与未感染细胞相比，表现出明显的核染色质凝聚模式改变，但DmNV ORF4信号并未与DAPI（细胞核）共定位。此外，DmNV在果蝇肠道中的感染模式存在变异，有些病例中感染局限于中肠的离散区域，而另一些则呈现更弥漫的侵袭模式。
讨论
本研究发现，虽然通过RT-PCR能从DmNV感染果蝇的头部检测到病毒基因组物质，但利用高特异性的smRNA FISH技术并未在脑组织中发现病毒RNA证据。这表明头部检测到的病毒遗传物质可能并非源于直接的脑组织感染，而更可能是通过血淋巴传播而来，或者是病毒附着在头部表面污染所致。先前研究中在感染果蝇头部检测到的DmNV特异性siRNA，也可能源于血细胞携带的、由病毒RNA逆转录产生的病毒DNA所触发的免疫反应，而非脑内病毒复制。
尽管有研究报告DmNV感染会上调果蝇脑内神经元表达的生物钟相关基因（如timeless和period），但本研究结果提示，这更可能是机体全身免疫反应的影响，而非病毒直接侵入脑细胞所致。类似于人类细小核糖核酸病毒感染（如脊髓灰质炎病毒）仅在小部分病例中表现出中枢神经系统受累，DmNV也可能仅在极少数情况下侵入脑组织，这或许可以解释为何需要大样本量（数千只）才能观察到感染果蝇与未感染果蝇在运动功能（如趋地性）上的差异。此外，本研究采用的经口感染途径可能限制了病毒的全身传播，若通过注射途径建立系统性感染，病毒或许能扩散至更多组织部位。
本研究验证了smRNA FISH作为一种检测果蝇组织中RNA病毒的有效方法。与传统免疫荧光或转基因荧光技术相比，该方法具有易于操作、特异性高的优点。通过严格的探针筛选，有效降低了脱靶结合导致的背景噪音。该方法为未来昆虫病毒研究，特别是可视化病毒在组织中的定位和分布，提供了一个可靠的技术选择。
综上所述，本研究结果表明，在经口感染条件下，DmNV能到达果蝇头部，但并未表现出对脑组织的广泛嗜性。病毒主要感染肠道上皮细胞，且感染存在个体差异。这些发现深化了我们对DmNV组织嗜性的理解，并为利用昆虫病毒模型研究病毒-宿主相互作用提供了新的见解和方法学支持。
