《Gut Microbes》：Phascolarctobacterium faeciumreduces food intake via PYY signaling, contributing to the mitigation of body weight gain in diet-induced obese mice
Phascolarctobacterium faecium通过PYY信号通路减少食物摄入并缓解饮食诱导肥胖小鼠的体重增加
ABSTRACT
过量能量摄入是导致肥胖的重要因素。本研究探讨了人类肠道细菌Phascolarctobacterium faecium是否能够通过肠内分泌途径预防饮食诱导肥胖（DIO）小鼠的肥胖。每日给予P. faecium（2×109cells/mouse）可通过早期过度产生饱腹激素肽YY（PYY）来减少食物摄入。此外，P. faecium增加了肠道支链氨基酸（BCAAs）水平，进而刺激神经内分泌细胞培养物中的PYY分泌，并改变了肠道菌群组成。配对喂养实验表明，P. faecium的厌食效应有助于减轻DIO小鼠的体重增加，但其代谢益处还涉及其他机制。具体而言，P. faecium加速了肠道转运和血清脂质清除，从而独立于食物摄入限制脂肪堆积。本研究揭示了一种与肥胖保护相关的人类肠道细菌的作用模式，为宿主-微生物相互作用调控体重提供了重要见解。
Introduction
肥胖已成为流行性疾病，其多因素病因使得开发有效疗法变得复杂。高热量、高饱和脂肪和简单糖的饮食会破坏能量平衡，显著扰乱控制食物摄入的下丘脑脑回路。肠道在控制食物摄入和能量稳态中也扮演重要角色，通过感知消化食物中的营养物质并将此信息传递至大脑。营养感应由肠上皮内特化的肠内分泌细胞（EECs）介导。EECs产生肠道激素，通过两种主要途径与大脑通信：（1）内分泌信号，即激素通过血液运输；（2）旁分泌信号，涉及激活支配肠粘膜的迷走传入神经元。
肥胖与厌食性胃肠道激素（如胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和肽YY（PYY））的分泌改变有关，其水平可能降低或升高，可能取决于餐后阶段和肥胖进展。因此，正在开发利用肠道肽机制的肥胖治疗方法。这些策略旨在模拟减肥手术后观察到的肠内分泌反应，如增强餐后GLP-1、PYY和CCK的分泌，共同促进体重减轻和改善葡萄糖稳态。这些方法包括肠道激素类似物和刺激肠道激素分泌的G蛋白偶联受体（GPCRs）激动剂（促分泌素），后者目前正在研究中。此外，大量证据表明，摄入西方饮食会改变肠道菌群组成，通过增加从食物中提取的能量来促进肥胖。肠道细菌还通过影响饱腹感和奖赏通路来影响宿主摄食行为。食物消化和发酵过程中产生的细菌成分和代谢物可以分别通过Toll样受体（TLRs）和GPCRs刺激EECs，导致食欲调节激素的合成和释放。例如，营养诱导的大肠杆菌生长促进了ClpB蛋白的产生，该蛋白通过增加PYY分泌和激活下丘脑前阿黑皮素（POMC）神经元来促进饱腹感。此外，由膳食纤维细菌发酵产生的短链脂肪酸（SCFAs），如乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，激活EECs上的FFAR2/3受体，促进GLP-1和PYY的分泌。尽管人类肠道细菌在减少肥胖热量摄入方面具有潜力，但确立其因果作用的直接证据仍然有限。一项为期四年的观察性研究发现，与体重正常增加的儿童相比，体重过度增加的儿童中Phascolarctobacterium属的丰度下降，并且在一项包括超过7500名成年人的大型荟萃分析中，P. faecium与超重和肥胖呈负相关。此外，Phascolarctobacterium与肥胖大鼠中二甲双胍或小檗碱治疗的抗糖尿病作用有关。在物种水平上，肥胖个体的热量限制导致P. faecium丰度增加，同时体重和内脏脂肪减少。然而，P. faecium在肥胖中的具体因果作用需要在转化研究中进一步调查。本文研究了P. faecium DSM 32890菌株（简称P. faecium）是否影响肠内分泌系统和食物摄入——这是一个在饮食诱导肥胖（DIO）中具有潜在抗肥胖效应的、 largely unexplored 的机制。利用体内模型（激素阻断和配对喂养模型）和体外实验系统，我们证明P. faecium通过增强PYY分泌（体重控制的关键因子）发挥厌食效应。我们的研究结果还表明，细菌本身及其升高的肠道代谢物（支链氨基酸，BCAAs）都充当PYY促分泌素。值得注意的是，我们发现P. faecium加速了肠道转运时间并减少了脂质吸收，这独立于其对食物摄入的影响，为肥胖预防提供了另一条途径。
Material and methods
Phascolarctobacterium faecium分离和培养条件
P. faecium DSM 32890（简称P. faecium）从健康志愿者的粪便中分离得到。用于体内实验时，P. faecium在补充有琥珀酸钠（8 g/L）代替葡萄糖的改良PYG培养基中，于37°C厌氧条件下培养48小时。离心（10000g，10分钟，4°C）和两次磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，将细胞重悬于含有0.05%半胱氨酸和20%甘油的PBS中。使用BD TrucountTM管和碘化丙啶染色，通过BD LSRFortessa流式细胞仪测定活菌数（cells/ml）。
小鼠、饮食和实验设计
6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠单独饲养在受控环境中。动物维持12小时光暗周期。除非另有说明，小鼠自由摄取对照饮食（CD，10% kcal来自脂肪，不含蔗糖）或高脂高糖饮食（HFHSD，45% kcal来自脂肪，21%来自蔗糖）。样本量基于先前的经验。小鼠称重后随机分配到实验组，确保各组间体重相似。所有动物实验程序均符合欧盟2010/63/EU和西班牙RD 53/2013规定，并经过巴伦西亚大学伦理委员会审查和批准。
我们通过以下实验探讨了口服补充P. faecium对DIO小鼠的影响：
实验1：HFHSD喂养的小鼠在12周实验期间，在暗期开始时（ZT12）每天接受一次P. faecium（2×109cells/mouse，溶于PBS加0.05%半胱氨酸，20%甘油）或载体（PBS加0.05%半胱氨酸，20%甘油）灌胃，而CD喂养的小鼠仅接受载体。每周测量体重，并在HFHSD喂养3、4和12周后测量24小时个体食物摄入量。在第4周，评估了接受载体或P. faecium的HFHSD喂养小鼠禁食过夜后的体重减轻。在HFHSD喂养4、8和12周后，动物禁食过夜后使用异氟烷麻醉，通过心脏穿刺获取血样。颈脱臼后立即收集大脑和盲肠内容物并速冻以备后续处理。第8周处死的小鼠用于制备结肠环肌肌间神经丛（CMMP）全mount标本，用于肠神经元和神经胶细胞的免疫染色。
实验2：为了进行配对喂养实验，小鼠喂食HFHSD 12周，并如实验1所述每天口服载体或P. faecium。额外一组也喂食HFHSD，进行24小时配对喂养，每天给予的食物量等于P. faecium处理组前一天的日均消耗量。配对喂养组口服给予载体。每周监测体重，并在ZT12每天测量食物摄入量。
在整个干预期间进行了各种功能评估，包括脂质肠道吸收、对口服营养挑战的PYY分泌和血糖反应、肠道转运时间和口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。
实验3：在喂食HFHSD 4周的小鼠中进行实验。我们首先进行了两项剂量反应研究，通过给予PYY抗体来验证PYY的免疫中和作用。随后进行了PYY阻断实验，以测试P. faecium是否需要PYY来发挥其厌食作用。
激素测量
使用MILLIPLEX Mouse Metabolic Hormone Expanded Panel在Luminex? MAGPIX系统上定量血浆总PYY、总GLP-1和胰岛素水平。使用Mouse Leptin ELISA在CLARIOstar微孔板阅读器上测定 leptin血浆水平。使用Mouse Insulin ELISA测量OGTT中0和15分钟时的胰岛素。
甘油三酯、胆固醇、NEFAs和柠檬酸合酶测量
使用相应的比色法测定试剂盒测量血浆中的甘油三酯、胆固醇和非酯化脂肪酸（NEFAs）。使用Citrate Synthase Assay Kit测量皮下白色脂肪组织（subWAT）中的柠檬酸合酶活性。
STC-1细胞系中的急性PYY分泌测定
肠内分泌 murine STC-1细胞在DMEM中培养。将细胞以1×105cells/well的密度接种在24孔板中，培养48小时至80%汇合。移除培养基并用PBS洗涤细胞。将细胞在DMEM中与巴氏灭菌的P. faecium（细胞与细菌比例为1:10，50μl）或等体积PBS预孵育15小时。然后，PBS预孵育的细胞进一步与PBS（对照）、支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，各100μM）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，10μM）或福斯高林（Fsk，10μM，阳性对照）孵育1小时。16小时（预孵育+孵育）后，收集上清液和细胞，处理并检测持续PYY分泌反应（由16小时P. faecium孵育诱导）和急性PYY分泌反应（由1小时BCAAs孵育诱导）。使用Mouse PYY EIA kit测定PYY。
Caco-2细胞中的脂质分泌测定
人结肠Caco-2细胞在EMEM中培养。将细胞以1×105cells/insert的密度接种在12孔Transwell板上。当细胞单层跨上皮电阻（TEER）>600 Ω×cm2时进行脂质分泌测定。将P. faecium（细胞与细菌比例1:10）或PBS（对照）添加到顶室细胞中，孵育16小时。PBS洗涤一次后，将含有脂质胶束（包含荧光脂肪酸BODIPY? FL C16）的培养基加入顶室15分钟。然后更换为新鲜培养基。在移除胶束后的15、120和240分钟，通过测量顶室和底室荧光来确定BODIPY? FL C16的分泌。
盲肠内容物中的代谢组学分析
根据LEITAT技术中心的标准方案，分析小鼠盲肠内容物中的胆汁酸（BAs）、短链脂肪酸（SCFAs）和支链氨基酸（BCAAs）。简要来说，通过AccQ-Tag化学衍生化后的超高效液相色谱（UPLC）定量BCAAs。通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析SCFAs，通过UPLC测定BAs浓度。
组织学、免疫组织化学和免疫荧光
固定的eWAT、subWAT和3厘米近端结肠组织石蜡包埋。WAT样品用苏木精和伊红染色，肠道样品进行免疫组织化学染色，使用1:9000稀释的抗PYY抗体量化PYY阳性细胞。使用Eclipse 90i Nikon显微镜捕获明场数字图像。使用Fiji软件选择单个脂肪细胞区域，并通过Nis elements BR 3.2软件进行量化。对于肠道样品，使用Nis elements BR 3.2软件选择和量化PYY阳性细胞和粘膜区域，并计算每单位粘膜面积的PYY阳性细胞数。
结肠肠神经元和神经胶细胞的免疫染色在CMMP全mount标本上进行。全mount标本在冰冷4%多聚甲醛中固定，用含有0.1% Triton X-100的1X PBS（T-PBS）洗涤，并在封闭液（4%正常驴血清，0.1% Triton X-100，1% BSA in PBS）中室温孵育45分钟。样品然后在4°C下与兔抗GFAP（1:200 v/v）和鼠抗peripherin（1:200 v/v）一起处理过夜。二级抗体驴抗兔Alexa Fluor 564（1:400, v/v）和驴抗鼠Alexa Fluor 488（1:400, v/v）在室温下应用2小时。每次孵育后用1X PBS洗涤。切片封固在ProLong Diamond Antifade mountant中。通过Zeiss LSM 980共聚焦显微镜的20倍物镜获取图像。使用Fiji软件分析图像，以量化15-20个组织横截面的平均相对荧光单位（RFU）或确定每平方毫米peripherin阳性神经元的数量。
RNA提取和RT-qPCR分析
使用TRIsure?试剂从下丘脑和subWAT中提取总RNA。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit进行逆转录。使用基因特异性引物对和LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix在LightCycler? 480 Instrument上进行实时qPCR。根据2–(ΔΔCt)方法计算各基因的相对mRNA水平。目标基因的量，以内参基因核糖体蛋白L19（Rpl19）标准化，表示为相对于对照组的mRNA fold-change expression。
粪便微生物群分析
如前所述进行微生物群分析。简要来说，使用QIAamp PowerFecal DNA kit分离粪便DNA。通过PCR从粪便DNA扩增细菌16S核糖体RNA（rRNA）基因的V3–V4可变区，纯化、定量产物，等量混合，并在Illumina MiSeq平台上以2×300 PE配置进行测序。基于参考数据集（SILVA数据库，Release 138）对原始数据进行配对末端组装、解复用和嵌合体去除。从稀释数据集（每个样本随机选择10,000条序列）并遵循无参考方法实施操作分类单元（OTU）方法。通过QIIME v1.9.1计算Alpha多样性描述符。通过基于距离的冗余分析（dbRDA）评估组间群落结构。对于分类学评估，使用完整的去噪数据集和组合微生物群衍生的（中心对数比 - CLR）数据，并先执行零插补（贝叶斯乘法替换）。使用SINA aligner和SILVA数据库（Release 138）支持OTUs的分类学鉴定。
统计分析
使用GraphPad Prism version 9.5.1进行统计学分析。通过D’Agostino & Pearson检验和Bartlett检验分别评估数据的正态性和方差齐性。使用单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey事后检验比较三个独立组。对于非参数数据，使用Kruskal-Wallis检验后接Dunn多重比较检验。使用双因素或三因素ANOVA评估变量之间的主效应和交互作用。当识别出交互作用时，进行Tukey事后检验。当p值p < 0.05时认为差异显著。使用GraphPad Prism version 9.5.1绘制图表。在R（version 4.1.2）中对微生物群数据进行统计分析，采用非参数方法，如Kruskal-Wallis检验和成对Wilcoxon秩和检验（用于非配对样本）。为了解释Alpha多样性描述符的多重比较，应用了Benjamini-Hochberg事后校正。使用vegan包中基于排列的adonis函数完成对通过解释性方法评估的微生物群落结构差异的统计稳健性。使用Kruskal-Wallis检验后接Benjamini-Hochberg校正确定组间OTU丰度差异。当Kruskal-Wallis校正p值≤0.01时，选择显示高度差异丰度的OTUs。使用Kendall等级相关确定相关性。使用GraphPad Prism version 9.5.1以及ggplot2和grid R v4.1.2包生成图表。使用欧几里得距离和完全聚类方法实现OTUs（缩放的DNA读数计数）的热图层次聚类。
Results
P. faecium通过放大PYY的产生和分泌减少饮食诱导肥胖小鼠的食物摄入
对喂食HFHSD 12周的小鼠口服给予P. faecium导致体重增加显著减少（图1a，p < 0.001），伴随eWAT（图1b，p = 0.019）和subWAT脂肪组织重量降低（图1b，p = 0.050）。未经处理的DIO小鼠的24小时食物摄入量显著高于CD喂养的小鼠（图1c，p = 0.003），而P. faecium给药降低了食物摄入，在12周干预后达到与CD喂养小鼠相当的水平（图1c，p = 0.020）。为了确定P. faecium在HFHSD喂养期间何时开始抑制食物摄入，我们在一个单独的实验中每周测量食物摄入量。P. faecium给药在4周时阻止了HFHSD喂养小鼠的食欲亢进发展，但在3周时没有（图1d，CD-Veh vs HFHSD-Veh，p = 0.014；HFHSD-Veh vs HFHSD-P. fae，p = 0.016）。具体来说，在自由摄食12小时后，食物摄入抑制在暗期观察到，而在明期没有（图1d：第3周，p = 0.019；第4周，p = 0.019）。
我们接下来研究了P. faecium在DIO早期阶段的厌食效应是否与代谢改善相关。P. faecium治疗在3周和4周给药期间减少了体重（图1e：第3周，p = 0.017；第4周，p = 0.020），尽管在4周干预结束时体重变化（Δ体重）没有显著的净差异，除了P. faecium有防止体重增加的趋势（与未处理的HFHSD喂养小鼠相比，t检验，p = 0.060）。与CD喂养的小鼠相比，未经处理的HFHSD喂养的小鼠显示subWAT重量增加（图1f：CD-Veh vs HFHSD-Veh，p = 0.009），而在P. faecium处理的小鼠中没有观察到这种效应（图1f）。各组间eWAT重量未检测到显著差异（图1f）。类似地，干预4周后，在未经处理的HFHSD喂养小鼠中观察到的血浆甘油三酯水平升高（图1g：CD-Veh vs HFHSD-Veh，p = 0.022）被P. faecium治疗降低（图1g：HFHSD-Veh vs HFHSD-P. fae，p = 0.054）。然而，在未经处理和P. faecium处理的HFHSD喂养小鼠中，胆固醇水平仍然升高（图1h）。此外，与未经处理的HFHSD喂养小鼠相比，P. faecium给药导致12小时禁食后体重减轻显著更大（图1i：CD-Veh vs HFHSD-Veh，p = 0.010，和HFHSD-Veh vs HFHSD-P. fae，p = 0.045），表明该细菌在DIO早期阶段增强了禁食期间能量储存（可能来自脂肪组织）的利用。
鉴于这些发现，我们分析了HFHSD喂养4周和12周时参与食物摄入中枢控制的下丘脑神经肽的基因表达。对厌食神经肽mRNA水平的分析显示，Pomc基因表达在未经处理的HFHSD喂养小鼠中显著高于CD喂养小鼠，但仅在干预结束时（第12周，图2a：CD-Veh vs HFHSD-Veh，p < 0.001），并且这被P. faecium给药正常化（图2a：HFHSD-Veh vs HFHSD-P. fae，p = 0.047）。相比之下，Cart表达不受HFHSD喂养或P. faecium处理的影响（图2a）。关于增食神经肽，Npy的mRNA水平在未经处理的HFHSD喂养小鼠中显著低于CD喂养小鼠，在HFHSD喂养4周和12周时都是如此（图2a：第4周，p = 0.002；第12周，p = 0.011）。在P. faecium治疗12周后也发现Npy表达较低，但在4周后没有（图2a，p = 0.002）。增食神经肽Agrp的转录水平与Npy基因表达谱相似，仅在HFHSD喂养12周后显示减少，无论小鼠是否接受P. faecium处理（图2a：CD-Veh vs HFHSD-Veh，p = 0.037 和 CD-Veh vs HFHSD-P. fae，p = 0.020）。
为了研究P. faecium如何减少DIO小鼠的食欲，我们测量了参与能量摄入调节的激素的血浆水平。在长期能量平衡中起作用的胰岛素和leptin在4周后未被HFHSD或P. faecium治疗显著改变（图2b和2c）。我们还测量了厌食激素GLP-1和PYY，它们由EECs在餐后分泌，在HFHSD喂养4周和12周后。P. faecium治疗在任一时间点都没有改变DIO小鼠的GLP-1水平（图2d），但它在HFHSD喂养4周和12周时显著增加了血浆PYY水平（图2e：HFHSD-Veh vs HFHSD-P. fae 第4周，p = 0.047；第12周，p = 0.019），而未处理的HFHSD喂养小鼠的PYY水平与CD喂养小鼠相似（图2e）。
这些数据共同表明，P. faecium给药从DIO早期就诱导了食欲降低效应，可能通过增加PYY分泌。这种早期的激素变化可能先于在体重和肥胖方面观察到的长期代谢益处。
为了进一步探索P. faecium如何刺激PYY，我们检查了对20%脂质乳剂（脂肪乳）营养挑战的PYY分泌反应。我们首先确定了在HFHSD喂养4周后，在未处理和P. faecium处理的小鼠中观察脂肪乳给药后PYY分泌的光暗周期最佳阶段。我们观察到PYY血浆水平受处理（载体/P. faecium）、喂养状态（禁食/脂肪乳）和每日阶段（明/暗）的影响。在暗期脂肪乳给药后，P. faecium处理的小鼠中发现了最高的PYY水平（图S2a）。事后分析证实，在P. faecium处理的小鼠中，餐后PYY水平在暗期显著高于明期（图S2a）。基于这些发现，我们在HFHSD喂养4周和12周后的暗期进行了分泌测定。4周后，观察到营养状态（禁食 vs. 脂肪乳）的显著主效应（p < 0.001）（图3a），表明脂肪乳给药后PYY水平升高。事后分析表明，响应脂肪乳，PYY水平在P. faecium处理的小鼠中特别增加，与未处理的HFHSD喂养小鼠相比，倾向于表现出更高的PYY浓度（图3a；p = 0.080）。另一方面，在HFHSD喂养12周后，发现了营养状态和处理之间的交互作用（图3a，p = 0.027）。事后分析显示，与未处理的小鼠相比，P. faecium处理的小鼠在脂肪乳给药后循环PYY水平更高（图3a，p = 0.032）。此外，脂肪乳给药诱导了CD喂养小鼠和P. faecium处理小鼠的PYY分泌，而不是未处理小鼠，当与禁食水平相比时（图3a：禁食 vs. 脂肪乳，CD-Veh的p = 0.012，HFHSD-P. fae的p = 0.006），突出了P. faecium在长期HFHSD喂养背景下维持适当肠道激素反应的好处。
由于这些数据进一步支持P. faecium在短期和长期内增强DIO小鼠的PYY分泌，我们接下来研究了阻断PYY是否可以逆转P. faecium的食物摄入抑制效应。我们首先通过腹腔注射抗PYY的IgG抗体并测量食物摄入来测试PYY免疫中和的有效性。在剂量反应实验中，我们发现，与接受盐水对照的小鼠相比，预先用10倍浓度（而非100倍浓度）的抗PYY抗体处理的HFHSD喂养小鼠在暗期12小时食物摄入显著增加（图S2b）。此外，在随后的4周初步实验中确认抗体效力，我们发现10倍剂量的抗PYY抗体显著减弱了外源性PYY给药在HFHSD喂养小鼠中引起的食物摄入减少（图S2c）。基于这些发现，我们然后在HFHSD喂养4周后测量了接受10倍剂量抗PYY抗体的未处理和P. faecium处理小鼠的食物摄入。与早期结果一致（图1c），P. faecium给药减少了接受盐水的HFHSD喂养小鼠的食物摄入（与未处理的HFHSD喂养小鼠相比）（图3b，p = 0.051）。然而，当小鼠同时施用PYY抗体时，未观察到这种食物摄入的减少（图3b）。
为了阐明P. faecium是否也影响肠道中的PYY产生，我们首先检查了回肠和结肠中Pyy以及转录因子Neurod1和Neurogenin 3（在EECs发育和分化中起重要作用）的基因表达。在结肠中，未处理的HFHSD喂养小鼠的Pyy转录水平升高（图3c：CD-Veh vs HFHSD-Veh，p < 0.001），而P. faecium将这些水平恢复到CD喂养小鼠的水平（图3c：HFHSD-Veh vs HFHSD-P. fae，p = 0.019）。在结肠中未检测到转录因子表达的显著差异；同样，这些基因在回肠中不受HFHSD或细菌处理的影响（图3c）。
最后，结肠的免疫组织化学分析显示，与未处理的HFHSD喂养小鼠相比，P. faecium处理的小鼠中每单位粘膜面积的PYY阳性细胞密度显著更大（图3d，p = 0.027）。Pyy mRNA表达和PYY蛋白水平之间的这种明显差异在生物学上是合理的，因为可能发生额外的转录后和分泌后调节过程。总而言之，我们的结果表明P. faecium增加了产生PYY的EECs的数量和PYY的分泌，并且这种PYY分泌过度可能是P. faecium处理的DIO小鼠减少食物摄入所必需的。
P. faecium驱动肠道菌群组成和衍生代谢物的变化
我们接下来分析了盲肠内容物中PYY促分泌素，如BAs、SCFAs及其支链形式（BCFAs）和与蛋白质诱导的厌食激素分泌相关的BCAAs。在所有分析的
