基于涡流分选技术预富集人调节性T细胞：加速分选进程并提升细胞早期适应性

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Vortex-actuated pre-enrichment accelerates human regulatory T cell sorting and improves early fitness

本文介绍了一种利用微流控涡流分选（VACS）技术对人调节性T细胞（Treg）进行CD4+CD25+预富集的新方法。与传统的CD25+免疫磁珠分选（IMS）相比，VACS预富集结合后续高纯度分选（VP方案）显著缩短了分选时间，并产生了具有更高细胞活性和更强早期扩增能力的Treg，其21天后的表型和抑制功能与IMS富集细胞相当，为符合药品生产质量管理规范（GMP）的Treg疗法生产提供了一种高效、温和的单平台封闭式工作流程。

　　

摘要

细胞分选对于调节性T细胞（Treg）疗法的生产至关重要。预富集可以减少分选时间，但比较不同方法的资料仍然稀缺。Highway1 是一种符合药品生产质量管理规范（GMP）的细胞分选仪，它利用瞬时涡流（即涡流驱动细胞分选，Vortex-actuated cell sorting, VACS）分离细胞，避免了磁性纳米颗粒的暴露，与免疫磁珠分选（Immunomagnetic separation, IMS）相比可能提高细胞活力。本研究比较了VACS与IMS富集后人Tregs的分选效果。Tregs直接从供体白细胞锥分离的外周血单个核细胞（PBMCs）中分选，分别采用三种方案：直接VACS纯度分选（DP）、CD4⁺CD25⁺VACS富集后VACS分选（VP）、或CD25⁺IMS阳性分选后VACS分选（25MP）。分选后的Tregs使用抗CD3/CD28刺激磁珠、白细胞介素-2（IL-2）和雷帕霉素进行扩增。结果显示，VP、25MP和DP产生的Tregs纯度相当。与DP相比，VP减少了分选时间但降低了得率。与25MP相比，VP导致了更少的晚期凋亡细胞和低增殖、IL-2低反应性细胞，并且产生的Tregs扩增程度更高。扩增21天后的表型标志物和抑制功能没有差异。CD4⁺CD25⁺VACS富集与直接VACS分选相比减少了Treg分选所需的时间，并且与CD25⁺IMS富集相比产生了扩增能力更强的Tregs，这支持了采用单平台、封闭的VACS工作流程，并证明了在GMP规模进行验证的合理性。

结果

CD4⁺CD25⁺VACS富集用于人Tregs可产生纯度相当、得率增加但分选速率低于CD25⁺IMS富集的Tregs

为比较VACS与IMS富集的性能，研究者使用两种方案分选新鲜分离的PBMCs：CD4⁺CD25⁺VACS富集模式后接VACS纯度分选（VP），或CD25⁺IMS阳性分选后接VACS纯度分选（25MP）。作为对照，同时进行了直接VACS纯度分选（DP）。不同的富集方式获得了较高且相似的Treg纯度（VP 95.9 ± 2.3%，25MP 95.1 ± 3.7% vs. DP 94.5 ± 3.1%）。然而，在富集后的细胞群体中，25MP的Treg纯度高于VP（58.8 ± 12.0% vs. 25.4 ± 13.0%）。VP每小时获得的Treg数量多于DP（0.55 ± 0.27 vs. 0.29 ± 0.17 × 10⁶Tregs/小时），但少于25MP（0.55 ± 0.27 vs. 2.06 ± 1.83 × 10⁶Tregs/小时）。VP的最终Treg得率（回收的Treg占初始PBMC中Treg的百分比）高于25MP（13.7 ± 4.0% vs. 9.6 ± 4.3%），但低于DP（13.7 ± 4.0% vs. 25.6 ± 9.8%）。处理每10⁶个PBMCs所需的总时间（富集+纯度分选），VP低于DP（5.9 ± 1.3 vs. 19.8 ± 0.8 分钟），但高于25MP（5.9 ± 1.3 vs. 1.4 ± 0.5 分钟）。Tregs在阴性组分中的残留比例（即富集后未被捕获的Tregs比例）在VACS富集和IMS富集之间没有差异。

CD4⁺CD25⁺VACS富集改善了早期扩增并产生与CD25⁺IMS富集具有相似表型和功能特征的Tregs

为比较不同分选方式获得的Tregs的特性，研究者对分选后的Tregs进行了长达21天的体外扩增。VP分选的Tregs在培养第6天（1.91 ± 0.86 vs. 0.47 ± 1.14 log₂倍扩增）和第14天（5.71 ± 1.14 vs. 2.94 ± 2.32 log₂倍扩增）的扩增程度均显著高于25MP分选的Tregs。至第21天，两者差异虽无统计学显著性，但仍有升高趋势。CD4⁺Foxp3⁺和CD4⁺Foxp3⁺Helios⁺细胞的频率随时间推移而降低，但VP与25MP之间无差异。考虑到初始分选时间，第21天最终产品中每小时获得的Treg数量在VP与25MP之间无差异。表型标志物、细胞因子产生、趋化因子受体表达和抑制功能在扩增21天后均无显著差异。基于平均处理时间、得率和扩增倍数进行估算，VP方案从5亿PBMCs开始，可预期在培养第21天获得足够数量的Tregs，满足当前临床试验的给药方案需求。

VACS分选的Tregs显示出更高的早期存活率和IL-2刺激反应性

为探究VP和25MP Tregs扩增能力差异的潜在机制，研究者评估了分选后第6天细胞的活力和增殖情况。与VP相比，25MP以及作为对照的CD8微珠阴性分选后VACS分选（8MP）或CD25微珠阳性分选（8M25M）方案，在第3天显示出更高的晚期凋亡细胞频率。多项式曲线拟合显示，VP分选Tregs的活细胞比例开始改善的时间点早于25MP。在第4天，VP分选Tregs的增殖指数高于25MP。为评估IL-2反应性，研究者对扩增6天并撤除IL-2休息2天的Tregs进行磷酸化STAT5（pSTAT-5）染色。结果显示存在两个 distinct 群体：一个对IL-2反应良好、增殖活跃的群体（pSTAT-5^high/VPD^low），另一个是对IL-2低反应、增殖不良的群体（pSTAT-5^low/VPD^high）。VP中这种低反应性群体的频率低于25MP。此外，在分选后即刻，VP和25MP的CD25表达无差异，但在扩增第6天，VP的CD25表达显著高于25MP。

讨论

本研究证明，与直接VACS分选相比，CD4⁺CD25⁺VACS富集后接VACS分选（VP）可以减少分选时间，并产生与25MP和DP纯度相当的Tregs。虽然VP比25MP慢，但其Treg得率更高，并且产生的Tregs在早期扩增更好，扩增后的表型和功能特征具有可比性。进一步的研究表明，与25MP分选的Tregs相比，VP分选的Tregs可能具有更高的存活率、更快的恢复能力、更强的增殖能力和更高的IL-2反应性。因此，VACS后的早期适应性优势可能降低培养失败率，并有可能缩短达到治疗剂量所需的时间。预富集有助于提高对稀有细胞群体的分选效率。虽然IMS能够批量处理大量细胞，因此在大规模（如GMP环境下）预富集细胞时比VACS更快，但VP可以减轻先前研究中描述的连续IMS后再进行FACS所导致的细胞损失和得率下降问题。分选仪诱导的细胞应激（Sorter induced cell stress, SICS）在多项研究中均有描述，而基于微流体的分选仪可能更温和，从而使细胞能够耐受连续的富集和分选。尽管本研究数据令人鼓舞，但需要注意的是，使用的是健康供体的白细胞锥而非患者材料，并且扩增是在体外而非体内评估的。

总之，CD4⁺CD25⁺VACS富集（VP）可能是直接VACS分选或CD25⁺IMS富集后接VACS分选（25MP）用于人Tregs分选的一种合理替代方案。虽然在培养第21天观察到的差异在不同工作流程间趋于收敛，表明长期功能相当，但VP带来的早期适应性优势对于生产中的批次可靠性和达剂时间具有重要意义。通过在单一封闭的微流体平台上结合预富集和纯度分选，VP在缩短分选时间、改善早期细胞适应性的同时，并未损害第21天的产品质量——这种平衡非常适用于临床生产。

材料与方法

PBMC分离、Treg分选与扩增

供体白细胞锥由英国NHS血液与移植机构（NHSBT）从匿名健康供体采集，并获得伦理批准。所有实验使用相同供体白细胞锥的PBMCs，以生成匹配样本进行比较。VACS富集时，PBMCs用特异性抗体染色后，使用Highway1细胞分选仪的富集模式进行CD4⁺CD25⁺细胞富集。IMS富集则使用相应的微珠和分离柱按照制造商说明进行。最终的CD4⁺CD25^highCD127^lowTregs使用Highway1的纯度模式从VACS富集后（VP）、IMS富集后（25MP, 8MP）或直接来自染色后的PBMCs（DP）中分选。分选纯度、得率、富集后Tregs残留比例等参数均被评估。分选后的Tregs在含有IL-2、雷帕霉素和CD3/CD28刺激磁珠的培养基中进行扩增。

扩增后Tregs的表型评估

在指定时间点，通过流式细胞术检测细胞表面标志物（如CD25, CD62L, TIGIT等）、细胞内转录因子（如Foxp3, Helios, GATA-3等）、趋化因子受体（如CXCR3, CCR4等）以及细胞因子（如IFN-γ, IL-4等）的表达。根据趋化因子受体表达对Treg亚群（如Th1样、Th2样、Th17样）进行分类。

体外Treg抑制实验

将扩增后的Tregs与经染料标记的自体PBMCs（反应性T细胞, Tresp）及CD3/CD28刺激磁珠共培养，设置不同Treg:Tresp比例。通过比较有/无Tregs共培养时Tresp的 division index (DI) 来评估Tregs的抑制功能，计算公式为：（有刺激无Tregs的DI - 有Tregs处理的DI）/ 有刺激无Tregs的DI × 100%。

细胞增殖与活力检测

分选后的Tregs用增殖染料染色后扩增，在培养第0至6天，通过 Annexin V 和 7-AAD 染色检测细胞凋亡和活力，并绘制活细胞和凋亡细胞频率随时间变化的曲线。

IL-2刺激后磷酸化STAT5检测

扩增第6天的Tregs撤除IL-2休息48小时后，用1000 IU/ml IL-2刺激，在特定时间点固定细胞，通过磷酸化流式细胞术检测STAT5蛋白酪氨酸694位点磷酸化（pSTAT-5）水平。

数据与统计分析

流式数据使用FlowJo软件分析。统计学分析使用GraphPad Prism进行，采用配对t检验或重复测量单因素ANOVA，p < 0.05认为有统计学意义。