《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Toward an age of CRISPR delivery with non-viral biologics
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为破解LNP肝外靶向难、免疫毒性高之困，研究者以MSC-sEV搭载Cas9 RNP，经μDES高效装载，在Myo7a耳聋模型中完成体内编辑并恢复听力20 dB，首次证实工程化胞外囊泡可兼具基因编辑与抗炎双重疗效，为CRISPR临床转化辟新径。
在基因治疗领域，CRISPR/Cas系统被誉为“分子手术刀”，却长期受困于“最后一公里”——如何把庞大的基因编辑机器安全、精准、高效地送到病变细胞？传统脂质纳米颗粒（LNP）虽已实现首例人体体内编辑，却因天然嗜肝性、重复给药的免疫激活及脂质毒性，对神经、耳蜗等肝外组织束手无策。遗传性耳聋更是一座“孤岛”：Myo7a基因突变导致毛细胞纤毛结构崩塌，患者幼年渐聋，无药可治。若能将Cas9核糖核蛋白（RNP）精准递入内耳，即可在源头修正突变，恢复听觉，但血-迷路屏障与耳蜗微小腔隙让LNP望而却步。于是，科学家把目光投向自然界已运转亿年的“快递小哥”——胞外囊泡（EV）。这些50–200 nm的膜囊泡自带“细胞通行证”，可穿越屏障、低免疫原性、可重复给药，却苦于“载货”效率低、量产难。如何让EV高效装载Cas9 RNP并精准抵达毛细胞，成为横亘在CRISPR与临床之间的下一座高山。
为回答上述难题，美国希望之城贝克曼研究所Tristan A. Scott团队与Pan等合作，在《Molecular Therapy Nucleic Acids》2026年3月号发表研究，首次报道利用间充质干细胞来源小胞外囊泡（MSC-sEV）结合微流控滴式电穿孔（μDES），将Cas9 RNP高效导入EV腔内，实现Myo7a突变小鼠的体内基因编辑与听力挽救。论文显示：μDES让Cas9装载效率跃升至80%，保留EV尺寸、表面电荷及标志蛋白；体内注射后，MSC-Cas9-EV特异性聚集于柯蒂氏器内外毛细胞，而LNP则滞留神经束；治疗6个月后，突变鼠听力阈值平均降低约20 dB（4–32 kHz），Myo7a-Sh1突变等位基因表达下降逾2倍，耳蜗氧化应激标志显著回落，且未现毒性。该研究为“低编辑-高功能”提供新范例，并预示工程化EV或成CRISPR肝外递送的下一代平台。
关键技术方法：
微流控滴式电穿孔（μDES）——在微流控芯片内生成纳升液滴，对MSC-sEV与Cas9 RNP实施高压瞬时电穿孔，实现80%装载效率。
转基因Myo7a-Sh1耳聋小鼠模型——模拟人类非综合征型渐进性听力丧失，用于评估体内编辑与功能恢复。
高通量sEV分离与表征——结合超速离心、NTA粒径分析、Western blot检测CD9/CD63/TSG101标志，确保EV质量。
深度测序与dPCR——定量柯蒂氏器组织插入缺失突变（indel）频率，评估体内编辑效率。
听觉脑干反应（ABR）——客观记录小鼠听力阈值变化，判断功能挽救程度。
研究结果：
μDES高效装载Cas9 RNP并保持EV完整性
通过优化电压与脉冲时间，μDES使sEV内Cas9阳性率提升至80%，显著高于传统电穿孔（约20%）与脂质转染；同时，sEV平均粒径（120 nm）与ζ电位（–18 mV）不变，CD9/CD63表达完好，Cas9体外切割活性保留。
MSC-Cas9-EV实现柯蒂氏器特异性生物分布
经圆窗膜注射，荧光标记Cas9在MSC-EV组主要定位于内外毛细胞胞体；LNP组信号则集中于螺旋神经节束。EV的独特分布与MSC天然向损伤组织归巢特性一致，为“低脱靶”奠定基础。
体内基因编辑效率与功能恢复并不线性匹配
在分离的原代耳蜗成纤维细胞中，体外indel达5.24%；而在整体柯蒂氏器，indel仅约0.02%，仍高于LNP组（0.005%）。尽管编辑比例“看似寒酸”，突变Myo7a-Sh1 mRNA水平下降>50%，ABR阈值降低20 dB，提示少量修正即可显著改善毛细胞机械-电转导，或与MSC-EV抗炎、抗氧化协同作用有关。
MSC-EV降低耳蜗氧化应激与炎症标志
RNA-seq显示，治疗组活性氧（ROS）通路、NF-κB信号显著下调，毛细胞凋亡减少；重复高剂量给药无体重下降、无肝肾功能异常，证实EV生物相容性与免疫特权。
结论与讨论：
该研究首次将“高装载-低毒性”的MSC-sEV平台与CRISPR RNP结合，突破LNP肝外递送瓶颈，实现遗传性耳聋的体内基因修正与功能挽救。尽管0.02%的indel频率远低于体外系统，却足以产生>20 dB听力收益，为“低编辑-高疗效”提供机制与数据支撑：一方面，耳蜗毛细胞对机械信号高度敏感，少量蛋白修正即可恢复纤毛刚度；另一方面，MSC-EV携带的miRNA与生长因子可抑制ROS，挽救继发损伤，形成“基因修正+微环境重塑”双重效应。研究亦揭示，未来需继续提升编辑效率、延长EV循环半衰期、开发规模化GMP工艺，并探索AAV共递送同源模板实现精准修复。随着Aera、Evox、Azalea等公司竞相布局外泌体-基因编辑管线（见Table 1），工程化EV或将在CNS、视网膜、耳蜗等“禁区”打开CRISPR临床新战场，真正实现“无病毒、少剂量、可重复”的基因治疗新时代。
