通过蛋白质组学和磷酸蛋白质组学方法研究从异养状态向高光胁迫状态的转变，发现红球藻（Haematococcus pluvialis，属于绿藻门）突变体中的叶绿素生物合成、碳分配以及虾青素生物合成和运输过程发生了变化

《Algal Research》：Exploring the transition from heterotrophy to high light stress using a proteomic and phosphoproteomic approach reveals altered chlorophyll biosynthesis, carbon partitioning, and astaxanthin biosynthesis and trafficking in a Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) mutant

海链藻突变体JWHIB 27–38通过重离子束诱变获得，其异养生长速率提高25%，高光压下油脂和虾青素含量分别增加69.61%和86.17%。蛋白质组学与磷酸蛋白组学分析显示，突变体通过上调叶绿素合成酶CPOX、虾青素合成关键酶PSY及 trafficking蛋白AstaP，同时将碳代谢转向脂肪酸合成途径，实现更高产物积累。

　　

Kyarii Ramarui|Jie Wang|Gary H. Wikfors|Yantao Li

马里兰大学海洋与环境技术研究所、环境科学中心及巴尔的摩县分校，美国马里兰州巴尔的摩市普拉特街东701号，邮编21202

摘要

Haematococcus pluvialis是一种天然的红藻素生产菌，但由于其生物量产量低和红藻素生产效率有限，工业生产方面的研究进展较为缓慢。由于对这种微藻中红藻素生物合成机制的理解尚不完全，通过菌株工程手段来提高其生长和红藻素产量也受到限制。本研究旨在通过培育出具有更强生长能力和更高红藻素产量的Haematococcus突变体，并探讨该藻类在从异养生长状态向高光照应力条件转变过程中的应激反应，从而克服这些瓶颈。我们采用物理辐射诱变方法培育出了在异养条件下分裂速率更高的Haematococcus突变体。其中JWHIB 27–38突变体在异养条件下的生长速率比野生型高出25%，在高光照应力下，其细胞脂质含量比野生型高69.61%，红藻素含量高86.17%。对比JWHIB 27–38突变体与野生型的蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析显示，突变体在高光照应力下仍能保持较高的叶绿素生物合成相关蛋白及磷酸蛋白（包括胆色素原氧化酶）的表达水平。突变体中脂肪酸生物合成相关蛋白（如生物素羧基载体蛋白）的上调表明，固定的碳被重新定向用于脂质合成。关键红藻素生物合成蛋白——植烯合成酶以及可能的红藻素转运蛋白AstaP的上调可能有助于增加突变体中的红藻素积累。这些差异表达的蛋白为未来通过菌株工程提高微藻红藻素产量提供了有希望的靶点。

引言

红藻素是一种脂溶性抗氧化剂，具有鲜艳的红色，其抗氧化活性是维生素E的100倍[1],[2]。这些特性使其在制药、营养保健品、化妆品、水产养殖和农业等多个领域具有极高的价值[3]。预计到2027年，全球红藻素市场规模将达到34亿美元[4]，这催生了对可再生红藻素来源的需求。Haematococcus pluvialis（绿藻门，旋藻目）是一种淡水绿藻，因其能产生占自身重量4–7%的红藻素而受到工业界的关注[5],[6]，是自然界中红藻素产量最高的物种。然而，由于生长速度慢和生物量产量低，H. pluvialis的工业化培养仍面临诸多挑战[7]。

在H. pluvialis的生命周期中，生物量积累与红藻素生产是相互排斥的：红藻素主要在细胞停止生长的应激条件下产生[3]。因此，通常采用两阶段培养技术：第一阶段提供富含营养的培养基和最佳生长条件，促进光生物反应器或发酵罐中的营养生长[7],[8]。这一过程采用异养模式进行，即在无光条件下为藻类提供外源碳源[3],[9]。异养生长模式具有多种工业优势，包括高密度培养[9],[10]、精确的营养控制、更好的污染防护[3],[11],[12]，以及更高的产品（如Omega-3脂肪酸或类胡萝卜素）产量，从而降低了收获和分离成本[9]。当生物量浓度达到最大值时，培养物进入“红阶段”，此时绿色营养细胞会经历光氧化（高光照）应力，最终转化为红色无鞭毛孢子（囊体）[3]。除了高光照应力外，Haematococcus细胞暴露于活性氧（ROS）诱导物质、营养匮乏或盐度变化等也能促进红藻素积累。高光照应力通常被选为诱导红藻素产生的最佳条件[3],[13]。

异养生长结束后，Haematococcus细胞的生理状态会影响其在红阶段的红藻素积累能力。例如，异养阶段提供的乙酸可被分解为乙酰辅酶A，这是多种代谢途径（包括脂肪酸生物合成）的关键前体[14]。在应激条件下，脂肪酸生物合成与红藻素积累呈正相关[15]，大约95%的红藻素以脂肪酸单酯或二酯的形式存在，这可能有助于提高红藻素在脂质体中的溶解度[16]。因此，增强的脂质生物合成能力可能有助于细胞积累更多的红藻素。

以往针对H. pluvialis生长缓慢的问题，主要通过优化培养基和培养条件来尝试改进，但效果有限[17],[18],[19]。随着微藻遗传工程工具的发展和基因组测序成本的降低，直接通过菌株工程调控特定代谢途径成为多种模式微藻的可行策略[18],[20]。然而，由于对其基因组和遗传工具的了解有限，针对H. pluvialis的定向菌株工程仍具有挑战性；目前大多数改良工作仍采用随机诱变后筛选理想表型的方法[3],[18],[21]。蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析有助于全面了解不同实验条件下的蛋白质和磷酸蛋白[22],[23]，从而为未来菌株工程提供潜在的靶点。

在本研究中，我们分析了通过重离子束诱变获得的Haematococcus突变体JWHIB 27–38（简称突变体J）的生长表现及差异表达的蛋白质和磷酸蛋白。该突变体在异养条件下始终比野生型具有更高的细胞密度。在高光照应力下，突变体J的细胞密度虽低于野生型，但细胞体积更大，生物量更高，且每个细胞中的红藻素含量也更高。我们分别在光照处理0小时、48小时和72小时后进行了蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析以验证表型结果。这项研究揭示了异养阶段细胞的生理状态如何影响高光照应力下的中心碳代谢、脂质生物合成和红藻素生物合成，并为未来的理性工程改进提供了潜在靶点。

菌株与培养条件

野生型Haematococcus pluvialis NIES 144来自日本国立环境研究所微生物培养 kolec tion（NIES），并在C培养基中维持生长。C培养基的成分如下[24]：0.96 g L^?1 CH₃COONa、0.15 g L^?1 Ca(NO₃)·4H₂O、0.10 g L^?1 KNO₃、0.05 g L^?1 β-甘油磷酸二钠盐水合物、0.04 g L^?1 MgSO₄·7H₂O、0.50 g L^?1 C₄H₁₁NO₃（Tris碱）、1 mg L^?1 Na₂ETDA·2H₂O、0.196 mg L^?1 FeCl₃·6H₂O、0.36 mg L^?1 MnCl₂·4H₂O、0.22 mg L^?1

突变体J的生物量、叶绿素、脂质和红藻素含量更高

突变体J是通过重离子束诱变产生的，从1546个候选突变体中通过检测750 nm光密度下的异养生长速率和细胞密度来筛选得到的。选择高异养生长速率作为筛选标准，以解决Haematococcus生长缓慢的瓶颈问题[8]。在实验室规模的两阶段培养实验中，突变体J表现出多种显著的表型差异

结论

我们分离出一种红藻素含量更高的H. pluvialis突变体，并通过蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析进一步研究了其表型特征。突变体J中叶绿素含量的增加可能与关键叶绿素生物合成蛋白（如CPOX和镁螯合酶）的上调有关。在高光照应力下，突变体J将碳分配途径从糖异生、淀粉积累和三羧酸循环中转移出来，转而促进脂肪酸生物合成

数据和材料的获取

质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库提交至ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD060374。本研究中使用的生物信息学工具均为免费或提供免费版本。

作者贡献声明

Kyarii Ramarui：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。Jie Wang：撰写与编辑、数据分析、概念构建。Gary H. Wikfors：撰写与编辑、监督工作、概念构建。Yantao Li：撰写与编辑、监督工作、资源协调、项目管理、方法设计、资金争取、概念构建。

代码公开情况

不适用。

资助信息

本研究得到了美国国家海洋和大气管理局教育合作计划（NA16SEC4810007）、马里兰工业合作伙伴计划（MIPS）项目（编号6510、7405和7602）的资助，以及马里兰大学海洋与环境技术研究所（IMET）天使投资者计划的部分支持。

未引用的参考文献

[70]

利益冲突声明

作者声明以下可能的财务利益或个人关系可能构成利益冲突：Yantao Li博士表示获得了美国国家海洋和大气管理局教育合作计划的资助；如果还有其他作者，他们也声明没有已知的财务利益或个人关系

致谢

我们感谢Lisa Guy、Katyanne Shoemaker博士、Mark Dixon和Diane Kapareiko（美国国家海洋和大气管理局渔业服务局东北渔业科学中心）在实验准备、实验设置和实施过程中提供的帮助。