《Applied Food Research》：Quality and safety preservation of pineapple sticks using the cell-free supernatant of lactic acid bacteria
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本研究针对鲜切菠萝易受酵母污染导致品质劣变的问题，探讨了三种乳酸菌（LAB）菌株（Pediococcus acidilactici CNTA 1059, Levilactobacillus brevis CNTA 1374, Lactiplantibacillus plantarum CNTA 600）的无细胞上清液（CFS）作为天然生物保护剂的潜力。研究发现，结合被动气调包装（MAP），P. acidilactici CNTA 1059的CFS能有效抑制腐败酵母（Meyerozyma spp.和Rhodotorula toruloides）生长，在12天冷藏期内较好地保持了菠萝条的色泽、质地和风味，感官接受度更高。全基因组测序（WGS）证实该菌株不携带可转移抗生素耐药基因且无致病性，并鉴定出pediocin PA-1生物合成基因簇。该研究为开发清洁标签的鲜切水果保鲜策略提供了安全有效的解决方案。
在当今追求健康、天然和可持续饮食的潮流下，消费者对清洁标签（Clean-label）和即食（Ready-to-eat, RTE）产品的需求日益增长。即食水果，特别是鲜切菠萝，因其方便食用而备受欢迎。然而，鲜切加工过程（如去皮、切块）会破坏水果的组织结构，触发一系列代谢和酶促反应，导致颜色褐变、质地软化、风味劣变，同时释放出的营养物质和水分也为微生物的生长提供了温床。即使是在冷藏条件下，鲜切菠萝的品质也会迅速下降，其货架期非常有限。传统的保鲜方法，如使用次氯酸钠进行消毒，因其可能产生有害的卤代副产物而在欧盟受到严格限制甚至不鼓励使用。因此，开发安全、有效的天然保鲜策略成为食品工业亟待解决的问题。
在此背景下，研究人员将目光投向了乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）。乳酸菌因其悠久的食品安全应用历史、公认的安全性（如欧盟的QPS资格和美国FDA的GRAS认定）以及其代谢产物所具有的抗菌活性，被视为理想的生物保护剂候选。与直接添加活的保护性菌种不同，使用乳酸菌的无细胞上清液（Cell-Free Supernatant, CFS）——即去除菌体后富含有机酸、细菌素（Bacteriocins）等代谢物的培养液——可以避免活菌在产品中可能带来的某些不确定性，同时发挥抗菌作用。此前已有研究表明LAB衍生的CFS在保鲜其他鲜切水果方面具有潜力。
为了验证这一策略对鲜切菠萝的有效性，研究人员在《Applied Food Research》上发表了一项研究，系统评估了三种特定LAB菌株的CFS，结合被动气调包装（Modified Atmosphere Packaging, MAP），对鲜切菠萝条品质和安全性的影响。研究遵循了一个清晰的步骤：首先识别导致菠萝腐败的主要微生物；然后通过初步筛选评估CFS处理对产品理化参数的影响；进而评估其抗菌潜力以筛选最有效的处理方案；随后在温度滥用条件下验证所选处理的效力并进行消费者感官评价；最后，深入探索所选CFS发挥抗菌活性的潜在机理。
关键技术方法概述
研究采用了多学科交叉的技术方法。微生物学方面，通过选择性培养基分离和26S rDNA测序鉴定了菠萝条中的主要腐败酵母。食品保鲜评估中，将菠萝条浸泡于不同LAB菌株的CFS中（5% v/w），并与被动MAP结合，在模拟商业冷链（先4°C 4天，后8°C 8天）和温度滥用（10°C）条件下储存，定期监测酵母菌落总数（CFU/g）。理化品质分析包括质地（穿刺测试）、成熟度指数（可溶性固形物/酸度）、色泽（CIELab*空间和数字图像分析褐变面积百分比）以及顶空气体组成。感官评价由训练过的消费者小组对色泽、气味、风味、质地和整体接受度进行评分。机制探索方面，进行了最低抑菌浓度（MIC）测定、对所选LAB菌株（P. acidilactici CNTA 1059）进行全基因组测序（WGS）以分析抗生素耐药基因、致病性和次级代谢物基因簇，并通过SDS-PAGE、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和酶谱法（Zymography）对CFS中的活性蛋白成分进行了表征。
研究结果
3.1. 鲜切菠萝中主要腐败微生物的鉴定
研究初期，通过微生物学分析确定，在腐败的鲜切菠萝中，并未发现显著的细菌污染，而是在PDA培养基上生长出两种形态不同的酵母菌落。经分子鉴定，这两种酵母分别为Meyerozyma spp.和Rhodotorula toruloides，它们被确认为导致菠萝产品劣变的主要腐败微生物。
3.2. 通过初步筛选研究CFS处理对微加工产品理化参数的影响
研究人员评估了三种LAB CFS处理对菠萝条在12天储存期内理化性质的影响。
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质地：与初始值相比，对照组（仅用被动MAP）的菠萝条硬度显著下降，而经P. acidilactici CNTA 1059 CFS处理的样品硬度反而有所增加，且显著高于MAP对照组，表明该CFS有助于维持菠萝条的硬度。
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成熟度指数：所有批次的成熟度指数在储存期间均有所上升，其中经P. acidilactici CNTA 1059和L. plantarum CNTA 600 CFS处理的批次指数最高，这可能与CFS中的代谢物影响了糖酸平衡有关，更高的成熟度指数通常与更甜的风味相关。
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色泽：色泽变化是决定处理方案是否可行的关键因素。经L. plantarum CNTA 600 CFS处理的菠萝条表现出最大的色差（ΔE）和最高的褐变面积百分比（46.42%），表明其对产品外观产生了负面影响。相反，P. acidilactici CNTA 1059和L. brevis CNTA 1374的CFS则显示出抑制褐变的能力，褐变面积百分比分别仅为9.46%和11.54%，显著优于对照组和L. plantarum处理组。因此，L. plantarum CNTA 600 CFS的处理方案被排除在后续研究之外。
3.3. 评估CFS的抗菌潜力以选择最有效的处理方案
微生物计数结果显示，在12天的标准储存后，对照组（无论是普通空气包装还是被动MAP包装）的酵母数量均达到约8-9 log CFU/g。而经P. acidilactici CNTA 1059和L. brevis CNTA 1374 CFS处理的样品，酵母数量被显著抑制在约6 log CFU/g。其中，P. acidilactici CNTA 1059 CFS结合MAP表现出最强的抑制效果，从初始到第12天的总增长量最低。结合理化指标（尤其是色泽保持），研究人员确定P. acidilactici CNTA 1059 CFS结合被动MAP为最优保鲜方案。
3.4. 通过温度滥用测试和消费者感官评价验证所选处理方案
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温度滥用条件下的微生物分析：在10°C的滥用温度下储存10天，对照组的酵母数量在第5天就达到8.26 log CFU/g，第10天升至9.10 log CFU/g。而经P. acidilactici CNTA 1059 CFS处理的样品，在第5天时酵母数量仅为4.32 log CFU/g，直到第10天才升至8.80 log CFU/g，有效延长了货架期约50%，证明了该处理方案对冷链中断具有一定的耐受性。
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消费者评价：感官评价结果清晰显示，未经处理的对照组菠萝条在第8天时因微生物生长和品质下降已被消费者拒绝（整体接受度评分<5）。而经P. acidilactici CNTA 1059 CFS处理的样品，在整个12天的储存期内，其色泽、气味、风味和质地均保持良好，整体接受度评分始终高于7分，显著优于对照组。这表明该处理不仅有效抑制了腐败，还很好地保持了产品的感官品质。
3.5. 探索所选CFS抗菌活性的潜在机制
为了解P. acidilactici CNTA 1059 CFS为何能有效抑制酵母，研究人员进行了深入的机制探索。
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体外抗菌活性：MIC测定表明，该CFS对R. toruloides具有剂量依赖性的抑制作用，5%的浓度即可完全抑制其生长。
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全基因组测序（WGS）：对P. acidilactici CNTA 1059菌株进行WGS分析证实，该菌株属于QPS列表中的物种，不携带可转移的抗生素耐药基因，被预测为对人类无致病性。更重要的是，基因组挖掘发现了一个与pediocin PA-1生物合成高度相似的基因簇。
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CFS的蛋白质表征：SDS-PAGE和LC-MS/MS分析在CFS中检测到了与pediocin PA-1及其相关蛋白（PedA, PedC, PedD）相符的肽段。酶谱法也证实了CFS中存在针对李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抗菌活性条带，分子量符合pediocin PA-1的特征。
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假定的抗菌机制：尽管确认了pediocin PA-1的产生（主要针对革兰氏阳性菌），但已知pediocin对酵母无直接活性。因此，CFS中对酵母的抑制作用更可能归因于其中含有的其他小分子代谢物，如乳酸、苯乳酸等有机酸，它们通过降低pH值和直接作用于真菌细胞膜发挥协同抗菌效果。此前的研究也表明P. acidilactici菌株能产生多种具有抗真菌活性的代谢物。
结论与意义
本研究得出结论，Pediococcus acidilactici CNTA 1059菌株的无细胞上清液（CFS）与被动气调包装（MAP）结合使用，是一种安全、有效的生物保鲜策略。它能显著抑制鲜切菠萝条中天然存在的Meyerozyma spp.和Rhodotorula toruloides酵母的生长，并将产品的货架期从8天延长至12天，同时很好地保持了菠萝的色泽、质地、风味和整体感官接受度。全基因组测序和代谢物分析从分子水平证实了该菌株的安全性和其产生抗菌物质（如pediocin PA-1）的能力，而其抗酵母活性可能主要源于有机酸等小分子代谢物的协同作用。
这项研究的意义在于，它为解决鲜切水果行业面临的保鲜挑战提供了一种符合清洁标签趋势的天然解决方案。使用LAB CFS避免了添加化学防腐剂，也规避了直接添加活菌可能带来的监管或感官上的顾虑。研究结果不仅适用于鲜切菠萝，也为其他易腐的微加工水果的保鲜提供了有价值的参考和潜在的应用前景，有助于推动食品工业向更天然、可持续的方向发展。
