《Bioactive Materials》：Nanozyme hydrogels remodel pathological microenvironment for temporomandibular joint osteoarthritis therapy via inhibiting MAPK signal pathway
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本研究针对颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）缺乏有效治疗手段的临床难题，创新性地构建了一种负载锰-氮-碳单原子纳米酶（Mn-NC SAzymes）的温敏性壳聚糖复合水凝胶系统。该研究揭示了该复合水凝胶通过模拟超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的双重活性，高效清除过量活性氧（ROS），并可持续释放Mn2+，从而抑制MAPK信号通路过度活化，减轻炎症反应、细胞外基质（ECM）降解和软骨细胞凋亡，同时促进软骨下骨修复，为TMJ-OA治疗提供了从症状缓解到功能重建的多维功能协同治疗新策略。
颞下颌关节是人体最复杂的关节之一，其健康关乎咀嚼、言语等重要功能。然而，颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）作为一种常见的慢性退行性疾病，却严重困扰着众多患者，导致关节疼痛、弹响甚至功能障碍，极大影响生活质量。传统的治疗方法，如保守治疗、关节腔内注射、关节镜手术等，虽能一定程度上缓解症状，但往往面临长期疗效不确定、药物副作用大、手术适用范围有限、植入物寿命短等挑战。因此，开发能够从根本上干预TMJ-OA病理进程的新疗法迫在眉睫。
在TMJ-OA的复杂发病机制中，氧化应激诱导的炎症被认为是关键驱动因素。病变关节腔内过量的活性氧（ROS）会破坏软骨细胞线粒体DNA，诱导软骨细胞凋亡，并刺激基质金属蛋白酶（MMPs）的产生，进而加速细胞外基质（ECM）的降解，最终导致软骨退化和钙化。尽管人体内存在超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶来清除ROS，维持氧化还原平衡，但在TMJ-OA的病理环境下，这些内源性防御系统往往不堪重负。此外，外源性补充生物酶存在纯化繁琐、成本高、反应条件苛刻、操作稳定性差等问题，限制了其临床应用。
面对这一困境，纳米酶（Nanozymes）——一类具有类似酶催化活性的纳米材料——应运而生。它们兼具天然酶的高效催化特性和纳米材料稳定性好、可大规模制备等优点。其中，单原子纳米酶（SAzymes）因其最大的原子利用率、可调的配位结构和独特的微环境调控能力，展现出更优异的催化活性和选择性。特别是金属-氮-碳（M-N-C）类单原子纳米酶，其活性中心结构与天然酶相似，具有广阔的应用前景。
在此背景下，研究人员将目光投向了锰（Mn）。锰是人体必需的微量元素，其可变价态使其在氧化还原反应中扮演重要角色，能有效清除体内过量的ROS。同时，锰还直接参与硫酸软骨素的合成和骨胶原的代谢，这意味着含锰纳米酶在发挥催化功能的同时，其降解产物可能直接参与并促进骨软骨组织的修复过程。为了将这种优异的纳米酶有效地递送至关节腔并长期留存发挥作用，研究人员巧妙地选用壳聚糖（CS）、β-甘油磷酸钠（β-GP）和羟乙基纤维素（HEC）构建了一种温敏可注射水凝胶作为载体。壳聚糖作为天然多糖，与关节软骨中的糖胺聚糖结构相似，具有良好的生物相容性和软骨诱导/整合活性；其分子链上丰富的氨基使其自身也具备一定的ROS清除能力。该水凝胶系统在室温下为溶胶状态，可通过注射方式微创植入关节腔，在体温下迅速转变为凝胶状态，形成三维网络结构，不仅能包裹纳米酶实现长效缓释，还能提供一定的机械支撑。
本研究创新性地采用无需高温热解的一锅法溶剂热技术，成功合成了具有明确Mn-N4配位结构的Mn-NC单原子纳米酶（Mn-NC SAzymes），并将其与壳聚糖基温敏水凝胶复合，构建了Mn-NC复合水凝胶系统（如Scheme 1所示）。该系统实现了原子级催化设计与局部递送系统的整合，充分发挥了Mn-NC SAzyme的协同双酶模拟活性（SOD和CAT）与壳聚糖的主动修复特性，克服了传统材料仅靶向单一部位的局限性。
研究人员首先对Mn-NC SAzymes进行了系统表征。结果证实，Mn原子以单原子形式分散在氮掺杂碳（NC）基质中，形成Mn-N4活性中心（图1c, d）。X射线吸收精细结构（XAFS）谱表明Mn的氧化态为+2价（图1h, i）。酶学性质评估显示，Mn-NC SAzymes具备优异的SOD样和CAT样活性（图2a-c）。密度泛函理论（DFT）计算揭示了其催化反应路径，表明Mn-N4结构是CAT样活性的主要活性位点，能有效降低反应能垒，促进O2和H2O的脱附，使催化反应持续进行（图2g-l）。
体外细胞实验表明，Mn-NC复合水凝胶（特别是最佳配比的CH@Mn2）具有良好的生物相容性（图4a, b）。在过氧化氢（H2O2）刺激的氧化应激模型中，CH@Mn2能有效保护软骨细胞，显著提高细胞活力，并高效清除细胞内ROS（图4c-e）。在白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的炎症模型中，CH@Mn2能显著抑制IL-1β引起的软骨细胞凋亡（通过TUNEL染色和流式细胞术检测早期凋亡率证实，图6a, b），并下调促凋亡蛋白Bax的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（图6c）。同时，CH@Mn2还能有效抑制IL-1β诱导的促炎因子（如TNF-α, IL-6）和基质降解酶（如MMP13, Adamts5）的表达（图5b-d, 图6d）。对巨噬细胞的研究进一步证实，CH@Mn2能抑制H2O2刺激下巨噬细胞向促炎M1型极化（CD86标志物下降），并促进其向抗炎M2型极化（CD206标志物上升），同时降低TNF-α、iNOS、IL-6、IL-1β等促炎因子的表达（图5e-i）。这些结果表明CH@Mn2能有效重塑炎症微环境。
转录组测序分析为阐明CH@Mn2的作用机制提供了更深层次的证据。与对照组相比，IL-1β刺激引起了软骨细胞大量基因的差异表达。而CH@Mn2处理则能显著逆转IL-1β诱导的基因表达变化（图10a, b）。基因本体（GO）富集分析显示，CH@Mn2显著调控了细胞外基质组织、炎症反应、细胞黏附等生物学过程（图10d）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，MAPK信号通路是CH@Mn2发挥作用的關鍵通路之一（图10e, f）。进一步分析发现，CH@Mn2能特异性抑制p38和JNK的磷酸化活化，而对ERK的磷酸化水平影响不大（图10h）。由于ROS是MAPK信号通路的关键上游调控因子，CH@Mn2通过其高效的ROS清除能力，阻断了ROS-MAPK上游调控轴，从而选择性抑制p38/JNK磷酸化，进而减轻IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应、ECM降解和细胞凋亡（图11）。
在促进软骨下骨修复方面，研究發現CH@Mn2可持续释放Mn2+（图3j），并能显著促进人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的成骨分化。表现为碱性磷酸酶（ALP）活性升高（图5j），以及成骨相关基因（ALP, BMP2, OPN）和蛋白表达上调（图5k）。
为验证其体内治疗效果，研究人员建立了大鼠TMJ-OA模型（通过关节腔内注射碘乙酸钠MIA诱导）。体内实验结果表明，与模型组（MIA）相比，CH@Mn2水凝胶治疗能显著改善关节软骨的组织学结构，增加软骨细胞数量，使肥大层增厚，降低OARSI评分（图7, 8a, h）。SO/FG染色显示CH@Mn2能更好地保留软骨中的蛋白聚糖（图7, 8b）。免疫组化染色证实CH@Mn2能促进II型胶原（COLII）的表达，并抑制MMP13的表达（图7, 8c, d）。同时，CH@Mn2还能抑制破骨细胞活性（TRAP染色阳性细胞数减少，图9f, g），并促进骨形成标志物骨桥蛋白（OPN）的表达（图9h）。Micro-CT三维重建及骨参数定量分析（骨小梁厚度Tb.Th增加、骨小梁分离度Tb.Sp减小、骨体积分数BV/TV增加）进一步证实了CH@Mn2对软骨下骨的良好修复作用（图9a-e）。此外，CH@Mn2在体内能有效调节滑膜炎症，抑制M1型巨噬细胞（CD86+）浸润，促进M2型巨噬细胞（CD206+）极化，并降低关节软骨中IL-1β的表达（图7, 8e-g）。体内生物分布和代谢研究表明，注射的CH@Mn2水凝胶能在关节腔内稳定滞留并缓慢降解释放Mn离子，主要经粪便排泄，且对主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）未发现明显毒性（附图S9），显示出良好的生物安全性。
关键技术方法概述（约200字）：
本研究的关键技术包括：1) 采用一锅法溶剂热合成制备Mn-N4配位的单原子纳米酶（Mn-NC SAzymes），并通过球差校正电镜、XAFS等技术表征其原子级分散结构与电子态；2) 构建基于壳聚糖/β-甘油磷酸钠/羟乙基纤维素的温敏可注射复合水凝胶作为载体，并系统评价其凝胶化时间、流变学性质、降解行为及Mn离子缓释动力学；3) 利用大鼠原代颞下颌关节软骨细胞、大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383及人骨髓间充质干细胞，通过体外氧化应激（H2O2）和炎症（IL-1β）模型，评估材料的细胞保护、抗氧化、抗炎、抗凋亡及成骨诱导活性；4) 通过转录组测序（RNA-seq）结合Western blotting深入探究其作用的分子机制，重点关注MAPK信号通路；5) 建立大鼠MIA诱导的TMJ-OA模型，通过关节腔内注射给药，利用Micro-CT、组织学染色（HE, SO/FG, TRAP）、免疫组化/免疫荧光等技术综合评价其体内软骨保护、软骨下骨修复及抗炎效果。
研究结果：
1. Mn-NC SAzymes的合成、表征与酶学性质
成功合成了系列Mn-NC SAzymes（Mn-NC-1, Mn-NC-5, Mn-NC-10）。表征确认Mn以单原子形式锚定在NC基质上，形成Mn-N4活性中心。Mn-NC-10表现出最优的CAT样活性，其H22清除率和O2生成量最高，SOD样活性与NC基质相当。DFT计算揭示了Mn-N4位点催化H2O2分解的机理和能垒优势。材料在PBS中可缓慢降解释放Mn离子，14天内CAT和SOD样活性虽有下降但仍保持较高水平。
2. Mn-NC复合水凝胶的构建与理化性质
成功将Mn-NC SAzymes负载于CS/β-GP/HEC温敏水凝胶中，形成可注射的复合水凝胶（CH@Mn）。该水凝胶具有均匀的三维多孔结构，良好的温敏性（37°C下快速凝胶）和剪切稀化特性，易于注射。流变学测试表明适量Mn-NC的加入（CH@Mn2）提升了水凝胶的弹性模量和抗应变变形能力。水凝胶在体外降解14天后重量保留率约40%，并能持续释放Mn离子。
3. 体外细胞水平验证抗氧化、抗炎、抗凋亡及促成骨作用
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细胞保护与ROS清除：CH@Mn2能显著缓解H2O2引起的软骨细胞活力下降，并有效清除细胞内ROS。
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抗炎与抗凋亡：在IL-1β诱导的炎症模型中，CH@Mn2能显著抑制软骨细胞凋亡（降低TUNEL阳性率及早期凋亡率，调节Bax/Bcl-2蛋白表达），下调促炎因子（TNF-α, IL-6）和基质降解酶（MMP13, Adamts5）的表达。对巨噬细胞，CH@Mn2能抑制其M1型极化及促炎因子释放。
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促成骨分化：CH@Mn2能促进hBMSCs的成骨分化，表现为ALP活性升高及成骨相关基因（ALP, BMP2, OPN）表达上调。
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机制初探：转录组学及蛋白验证表明，CH@Mn2通过清除ROS，抑制MAPK信号通路中p38和JNK的磷酸化，从而发挥其抗炎、抗凋亡及保护ECM的作用。
4. 体内动物模型验证治疗TMJ-OA的效果
在大鼠TMJ-OA模型中，关节腔内注射CH@Mn2水凝胶后：
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软骨保护：改善软骨组织结构，增加细胞数量，减少蛋白聚糖和II型胶原丢失，抑制MMP13表达，降低OARSI评分。
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软骨下骨修复：Micro-CT及组织学分析显示，CH@Mn2治疗组骨小梁结构改善，骨量增加，破骨细胞活性受抑制，成骨活性增强。
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抗炎作用：调节滑膜巨噬细胞极化，抑制M1型（CD86+），促进M2型（CD206+），降低关节内IL-1β水平。
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生物安全性：材料在体内缓慢降解，Mn离子可被代谢清除，对主要脏器未见明显毒性。
研究结论与讨论：
本研究成功开发了一种负载Mn-NC单原子纳米酶的温敏可注射复合水凝胶系统，用于TMJ-OA的治疗。该研究的主要结论和重要意义在于：
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材料创新：采用非热解策略合成了具有明确Mn-N4结构的单原子纳米酶，并将其与生物相容性良好的壳聚糖基水凝胶巧妙结合，构建了一个集催化治疗、药物递送和生物修复于一体的多功能平台。
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机制深入：系统阐明了该复合系统通过模拟SOD和CAT的双重酶活性高效清除ROS，进而抑制MAPK信号通路（特别是p38/JNK）的过度激活，从而减轻炎症反应、ECM降解和软骨细胞凋亡的分子机制。转录组学分析为理解其多靶点作用提供了依据。
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功能协同：该体系不仅通过纳米酶的催化活性消除致病因素（ROS和炎症），还借助壳聚糖的固有生物活性以及缓释的Mn离子直接参与并促进软骨下骨的修复与再生，实现了“抗炎-抗氧化-促修复”的多维功能协同。
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治疗策略革新：这种基于纳米酶水凝胶的局部微创治疗策略，有望实现一次注射长期有效，将TMJ-OA的治疗思路从传统的症状缓解提升到病理微环境重塑和关节功能重建的新高度。
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转化潜力：研究所用材料组分（壳聚糖、锰）生物相容性较好，水凝胶具备可注射性和温敏性，便于临床转化。详细的体外、体内实验数据证明了其有效性和安全性，为后续开发用于退行性关节疾病治疗的新型生物材料提供了新思路和实验依据。
该研究工作发表于《Bioactive Materials》，其研究成果不仅为TMJ-OA的治疗提供了有前景的新方案，也为利用纳米酶技术治疗其他氧化应激相关疾病（如其他类型的骨关节炎、炎症性肠病等）提供了有价值的参考。
