《Bioactive Materials》：An AI-assisted designed supramolecularly engineered nanoplatform reverses pigmentation by triggering an ineffective compensatory melanin production program
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本研究针对天然产物黄芩苷(BA)生物活性高但透皮吸收差的瓶颈问题，开发了一种AI辅助设计的超分子杂化纳米平台(DHBTC)。研究人员通过AI逆向设计筛选出氨甲环酸(TA)作为协同配体，构建了双重组装纳米系统，使BA溶解度提升608倍。研究首次发现该平台通过诱导自噬介导的黑素体降解实现“功能性抑制”色素沉着，并重塑皮肤免疫微环境至抗炎状态。该工作为天然产物的功能化递送系统设计提供了从计算预测到机制探索的全链条策略，具有重要的科学意义和临床转化价值。
在当今药物研发领域，众多高活性先导化合物因水溶性差和生物膜渗透性低而难以成为 viable drugs（ viable drugs），这一生物药剂学瓶颈在透皮给药中尤为突出。作为机体的第一道防线，皮肤最外层的角质层由紧密排列的角化细胞和脂质双分子层构成，形成了 formidable barrier（ formidable barrier），极大地限制了大多数外源性分子的渗透。当治疗策略需要共同递送两种或更多理化性质迥异的活性分子时，例如疏水性和亲水性药物共存，传统的单一制剂平台往往难以同时满足这些矛盾的递送要求，这成为皮肤病药物递送领域一个长期的技术难题。
黄芩苷(BA)作为从中药黄芩中提取的黄酮类化合物，是面临这一挑战的典型临床价值案例。它具有 potent antioxidant（ potent antioxidant）、抗炎和抗光老化活性，在治疗皮肤色素沉着过度、炎症性皮肤病等方面展现出巨大的治疗潜力。然而，作为典型的生物药剂学分类系统IV类药物，BA极低的水溶性和差的渗透性导致其透皮吸收可忽略不计，难以在靶组织达到治疗浓度，长期阻碍其临床转化。为了应对BA的递送挑战，虽然已有研究开发了微乳、固体脂质纳米粒和纳米结构脂质载体等多种剂型，并取得了一定成功，但这些策略本质上仍依赖于“被动包封”，未能从分子层面改变BA自身不利的理化性质。且当涉及联合递送时，伴侣分子的选择通常基于其既定的临床应用，而非其与BA形成稳定高效递送实体的内在理化协同性。这种依赖经验、试错筛选的模式限制了发现更优分子组合的可能性。
超分子自组装策略为这些挑战提供了强有力的解决方案。通过利用氢键、π-π堆积和主客体相互作用等非共价相互作用，超分子工程能够将不同性质的药物分子精确组织成热力学稳定的纳米结构。这种方法不仅有效解决了增溶和共递送的技术瓶颈，还赋予递送系统动态可逆性和智能响应释放等独特优势。因此，构建功能性超分子组装体是 revitalizing insoluble natural active ingredients（ revitalizing insoluble natural active ingredients）的一条充满前景的途径。
本研究提出了从“正向筛选”到“AI引导的逆向设计”的范式转变，旨在回答一个核心科学问题：如何利用AI引导的超分子工程来 bridging the "high bioactivity–low bioavailability" gap（ bridging the "high bioactivity–low bioavailability" gap）的天然产物如黄芩苷，并 thereby reveal their unique intracellular homeostatic regulation mechanisms（ thereby reveal their unique intracellular homeostatic regulation mechanisms）？研究超越了传统的惰性载体概念，将人工智能作为理性发现工具，从广阔的化学空间中筛选出亲水性分子氨甲环酸，其不仅是增溶剂，更是协同的“活性辅料”。在此基础上，构建了 hierarchical supramolecular engineering platform (DHBTC)（ hierarchical supramolecular engineering platform (DHBTC)）。该系统通过氢键介导的共组装和主客体包合，在分子水平上解决了递送悖论，使溶解度提升了608倍。进一步，利用单细胞转录组学和功能验证，研究阐明了一种新颖的治疗机制：该纳米平台通过诱导自噬介导的黑素体清除——触发无效的转录补偿——从而实现功能性抑制色素沉着，同时将皮肤免疫微环境重塑至稳态。这项工作提出了一种设计功能性药物递送系统的整体策略，整合了计算预测、超分子组装和细胞稳态的机制调控。
为开展研究，作者团队主要应用了以下几项关键技术：AI驱动的逆向设计与分子动力学模拟，用于筛选配体并预测相互作用；超分子组装与表征技术（包括核磁共振、傅里叶变换红外光谱、差示扫描量热法等），用于构建和验证纳米平台(DHBTC)的形成与性质；体外透皮模型与细胞生物学技术（如细胞划痕、ROS检测、免疫荧光、Western blot等），用于评估递送效率及抗氧化、抗炎、促自噬等生物活性；UVB诱导的小鼠皮肤色素沉着模型，用于体内药效评价；以及单细胞RNA测序(scRNA-seq)，用于在单细胞分辨率下揭示其调控皮肤微环境及黑色素细胞内在转录程序的深层机制。
2.1. AI驱动的超分子结构设计与可靠性验证
研究采用AI驱动的逆向设计策略识别BA的分子伴侣。基于159个实验条目数据集构建并训练了反向传播神经网络模型，结合遗传算法进行全局优化搜索，最终鉴定出氨甲环酸为最佳生物活性伴侣。密度泛函理论计算通过静电势分析和独立梯度模型等证实了BA与TA之间存在电荷互补性和强大的氢键作用，为AI预测提供了理论支持，并精确描绘了由多点协同氢键网络稳定的BATABT组装模式。
2.2. BT组装体的制备、表征与性能分析
根据理论预测，通过溶剂蒸发法制备了不同摩尔比的BT组装体。核磁共振氢谱、二维核奥弗豪泽效应谱、傅里叶变换红外光谱等一系列光谱表征证实了BT组装体的成功形成及分子间相互作用。差示扫描量热法曲线显示BT组装体呈现单一的玻璃化转变温度，表明其是均匀且热力学稳定的系统。扫描电镜和透射电镜观察表明BT在水中能自发自组装成均匀的球形纳米粒，动态光散射显示最优配比(1:1)的BT纳米粒流体动力学直径约为156.48 nm，且纳米混悬液表现出优异的物理稳定性。更重要的是，该组装体的形成使BA的表观水溶性提升了569倍。
2.3. 超分子杂化纳米平台(DHBTC)的构建与表征
为进一步优化BT组装体的递送性能，选择生物相容性的羟丙基-β-环糊精作为主体分子，通过主客体相互作用包封BT纳米核，构建最终的DHBTC。DFT计算模拟表明BT组装体中BA的疏水部分优先插入HP-β-CD的疏水空腔，主客体间存在广泛的范德华吸引力，该包合过程是热力学自发的。实验表征证实DHBTC形成了新的固相，其纳米粒粒径增大至约196 nm，zeta电位变为-6.1 mV。差示扫描量热法和热重分析进一步提供了DHBTC新相形成的证据。二次组装进一步将BA的溶解度提升至97.3 mg/mL（约608倍），且HP-β-CD包覆显著提高了纳米系统的物理稳定性。
2.4. DHBTC通过可逆角质层流化实现高效透皮递送
通过分子动力学模拟、离体猪皮肤透皮实验等一系列多尺度研究评估了DHBTC的递送性能。分子动力学模拟预测BT组装体能更有效地插入高度有序的脂质分子中并显著破坏其排列，增加双层膜的流动性。离体透皮实验显示，DHBTC组的BA累积透皮量在20小时内达到69.7 μg/cm2，显著高于BA原药和物理混合物组，且皮肤组织中的BA滞留量显著增加。傅里叶变换红外光谱分析为DHBTC引起角质层脂质链构象无序化增加（即“流化”机制）提供了直接的光谱证据，表明其促渗作用是一个高效且可逆的物理过程。
2.5. DHBTC通过激活Nrf2通路发挥强大抗氧化功能
细胞实验表明，DHBTC在高达0.5 mg/mL浓度下对Hacat细胞表现出优异的生物相容性。在UVA诱导的细胞氧化应激模型中，DHBTC表现出最强的ROS清除能力。在H2O2诱导的氧化应激模型中，DHBTC能最有效地恢复应激抑制的内源性抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）的活性。Western blotting分析证实，在UVB照射的细胞模型中，DHBTC处理显著上调了Nrf2及其下游靶蛋白NQO1的表达，表明其抗氧化功能是通过激活Nrf2信号通路实现的。在UVA照射的HSF细胞模型中，DHBTC能最有效地抑制负责胶原降解的基质金属蛋白酶-1的基因表达，并逆转UVA诱导的TIMP-1下调，同时显示出对透明质酸酶的抑制作用，证实其具有显著的抗氧化和抗光老化潜力。
2.6. DHBTC在细胞水平的抗炎和促自噬作用
在脂多糖诱导的RAW264.7炎症模型中，DHBTC表现出强大的抗炎活性，能显著抑制IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6和PGE2等多种关键促炎细胞因子的表达。免疫荧光染色显示，DHBTC能有效阻断LPS刺激引起的NF-κB p65亚基的核转位，并最强效地抑制激动剂辣椒素刺激引起的TRPV1通道表达上调。在自噬方面，使用MDC荧光探针和LC3B免疫荧光检测发现，DHBTC处理能显著增加细胞内自噬体的形成和LC3B阳性斑点的数量密度，并上调自噬相关关键蛋白ATG7的表达，表明其能有效激活细胞自噬。
2.7. DHBTC局部应用有效改善UVB诱导的小鼠皮肤色素沉着过度
在UVB诱导的C57BL/6小鼠皮肤色素沉着模型中，为期4周的体内药效评价证实了DHBTC的治疗效果。DHBTC治疗能显著降低皮肤组织中的ROS和MDA水平，恢复并增强SOD和GSH-Px等内源性抗氧化酶活性，同时显著抑制促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平。生化分析和免疫荧光显示，DHBTC治疗能显著抑制皮肤组织中的黑色素合成，并显著下调黑素生成通路关键蛋白DCT、MITF、TYR和TYRP1的表达。这些数据共同描绘了DHBTC的作用机制：通过其多方面的生物活性（抗氧化、抗炎），抑制激活MITF的上游信号，进而下调黑素生成相关蛋白的表达并直接抑制关键酶活性，最终导致黑色素产量减少。
2.8. 单细胞转录组学揭示功能抑制与补偿性转录反馈机制
对对照组和DHBTC处理组皮肤样本进行的单细胞RNA测序分析，在单细胞分辨率下揭示了DHBTC的作用机制。比率分析显示，治疗后黑色素细胞的相对比例显著降低，而T细胞和髓系细胞等主要免疫细胞群体的相对比例显著增加，表明皮肤微环境发生重塑。对黑色素细胞的转录组分析发现一个与宏观表型矛盾的现象：DHBTC处理组中，与“黑素体”相关的生物通路基因显著富集，核心黑素生成酶基因和黑素体转运相关基因的转录水平均显著上调。基因集富集分析显示，DHBTC处理组的黑色素细胞中，溶酶体和自噬相关通路均呈现高度显著的正向富集。研究者提出假设：DHBTC通过在翻译后或功能水平上有效抑制黑色素生产和积累，导致细胞感知到功能性的“黑色素赤字”，从而触发补偿性转录反馈循环。而自噬-溶酶体系统的激活是清除黑素体的主要机制，这可能是触发上游补偿性转录反馈的根本原因。细胞间通讯分析表明，DHBTC治疗后，皮肤微环境中的整体细胞间相互作用网络增强，但关键的促炎通路信号强度显著减弱，NF-κB信号通路在T细胞和髓系细胞中均受到显著抑制，表明皮肤免疫微环境从促炎状态转变为抗炎或稳态。
2.9. DHBTC纳米平台的全面安全性评估
系统的安全性评估表明，DHBTC在高达0.5 mg/mL浓度下对多种细胞系保持良好相容性，其超分子杂交策略成功减轻了高浓度BA的毒性作用，显著拓宽了其安全窗口。离体猪皮肤结构完整性分析和苏木精-伊红染色等结果表明，DHBTC的促渗作用是由热力学溶解度梯度驱动，而非化学性破坏皮肤屏障。长期体内实验证实，DHBTC能有效逆转UVB照射引起的表皮增厚和炎症细胞浸润等病理变化，保护真皮胶原网络，且给药部位未见红斑、水肿或过敏反应，确立了其优异的生物安全性。
3. 讨论与结论
单细胞转录组学揭示的一个核心发现是这种悖论现象：纳米平台在有效逆转色素沉着过度的同时，却系统性上调了黑色素细胞内整个黑素生成基因网络。研究者提出，这反映了一种“功能性抑制”的复杂机制，其治疗效果是通过破坏翻译后过程而非抑制基因表达来实现的。DHBTC通过特定的“自噬依赖性清除”机制诱导功能性抑制，其有效递送BA触发了自噬-溶酶体通路的强烈激活，导致黑素体被快速降解，这在细胞内造成了功能性的“黑色素赤字”。细胞稳态机制感知到此赤字后，通过激活MITF作出反应，触发黑素生成基因的“无效”补偿性转录上调。然而，由于合成的蛋白质被持续靶向降解，这种补偿无法恢复色素水平。此外，与直接清除黑色素细胞的作用不同，DHBTC在第二个维度上通过重塑皮肤免疫微环境发挥作用，将皮肤从促炎状态转变为更静止、稳定的抗炎状态。其AI辅助策略的独特优势在于双靶向能力，确保了筛选出的配体不仅是惰性增溶剂，更是协同的生物活性剂，实现了从“惰性载体”到“功能性载体”的设计逻辑飞跃。该研究展示了一种设计功能性药物递送系统的整体策略，为天然产物的功能化递送及其细胞稳态调控机制的探索提供了从计算预测、超分子组装到机制研究的全链条方案。
