关于红海鲷虹彩病毒致病机制的见解：利用膜酵母双杂交技术和分子动力学揭示宿主-病原体相互作用

《Bioorganic Chemistry》：Insights into Red Sea bream iridovirus pathogenesis: Unveiling host-pathogen interactions using membrane yeast two-hybrid and molecular dynamics

红海鲈鱼虹彩病毒（RSIV）主要 capsid 蛋白（MCP）与宿主 HSC70 蛋白通过氢键和范德华力结合，结合自由能为-318.45 kJ/mol，关键残基为646ILE和452ILE，为抗病毒药物和疫苗开发提供理论依据。

　　

陈伟超|于家龙|何美佳|吴海莲|邱德奎|赵超

中国福建省农林大学海洋科学学院，福建省海洋生物技术重点实验室，海水养殖育种国家重点实验室，福州

摘要

红海鲷虹彩病毒（RSIV）属于Megalocytivirus属，通过感染海洋鱼类对全球水产养殖构成了严重威胁。其主要衣壳蛋白（MCP）是RSIV的主要免疫原成分，但其致病机制尚不清楚。本研究采用蛋白质相互作用筛选与基于人工智能的结构预测相结合的方法，阐明了RSIV与其宿主之间的相互作用机制。具体而言，通过构建红海鲷膜蛋白的酵母cDNA文库，并利用膜酵母双杂交系统，筛选出针对RSIV-MCP的cDNA文库，从96个阳性克隆中鉴定出53个不同的宿主相互作用伙伴。反向验证证实了所有候选蛋白之间的强相互作用，包括热休克蛋白Hsc70、HSP90β和HSC71样蛋白。利用AlphaFold3进行结构预测，我们获得了MCP和HSC70的高置信度模型，从而可以进行分子对接和动力学模拟。结果表明，该复合物在100纳秒内保持结构稳定，这从均方根偏差和回转半径值的收敛情况可以看出。计算分析显示，在结合界面存在广泛的氢键网络。这一发现还得到了结合自由能（-318.45 kJ/mol）的支持，表明MCP与HSC70之间可能存在强烈的相互作用。突变分析表明，残基646ILE和452ILE是复合物形成的关键介质，氢键和范德华力是主要的稳定作用力。这些结果为理解RSIV-宿主蛋白质相互作用提供了见解，为研究病毒致病机制和开发针对这一具有经济意义的水生病原体的靶向治疗策略奠定了基础。

引言

红海鲷虹彩病毒（RSIV）属于Iridoviridae科的Megalocytivirus属，是一种主要感染海洋鱼类的病原体，对水产养殖构成严重威胁[1]、[2]。RSIV的流行具有明显的季节性，并且高度依赖于水温。该病毒主要通过水平传播途径传播，健康鱼类通过直接接触患病个体、受污染的水体、饲料或设备（如未经消毒的网具和容器）而感染[3]、[4]、[5]。

RSIV的主要衣壳蛋白（MCP）是病毒免疫原性的主要来源，也是PCR检测中用于病原体鉴定和分类的常用目标基因。目前，疫苗接种是预防RSIV的主要方法。已经开展了多项疫苗研发工作，包括基于福尔马林灭活病毒的疫苗[6]、[7]、[8]、基因疫苗[9]以及使用重组酵母细胞制备的口服疫苗[10]。目前用于红海鲷幼鱼的疫苗在诱导细胞介导的免疫反应方面效果有限，且免疫原性较低[11]。此外，基于DNA的疫苗由于可能将病毒成分释放到海洋环境中而引发生态问题[12]。因此，越来越多的免疫刺激剂和治疗药物被用作预防鱼类疾病的替代策略。

膜酵母双杂交（MYTH）系统是一种方法学平台，利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模型宿主生物，在体内条件下检测和表征膜蛋白及其相关蛋白的相互作用[13]。在该系统中，检测方法被设计为蛋白质-蛋白质相互作用的分子“传感器”。 bait膜蛋白在其N端或C端通过基因融合的方式与包含Cub结构域的嵌合模块以及合成转录因子（TF）结合[14]、[15]。由于其灵活的设计，MYTH平台易于进行高通量分析，适用于大规模相互作用组筛选和针对性小规模相互作用分析。该系统已成功用于表征外源或内源表达的蛋白质在多种生物物种中的短暂和稳定相互作用[16]。

在本研究中，将RSIV-MCP基因克隆到pBT3-SUC载体中，用作bait来筛选红海鲷膜酵母双杂交文库。主要目的是通过MYTH筛选系统系统地鉴定与MCP相互作用的宿主膜蛋白。阳性克隆随后经过多报告基因检测、DNA测序和BLAST分析。根据生物学相关性和相互作用强度，选择了MCP-HSC70复合物进行深入研究。因此，次要目标是利用蛋白质建模、分子对接和分子动力学模拟对该关键复合物进行详细的结构表征。这些发现有望为开发针对RSIV的药物和疫苗提供候选靶点和理论基础。

部分摘录

膜次级文库的储存容量和插入片段长度的鉴定

为了确定文库容量，将10 μL电穿孔后的细菌培养物稀释10,000倍，然后将100 μL稀释后的悬浮液涂布在含有氨苄西林（Amp）的LB琼脂平板上，然后在37°C下倒置培养过夜。第二天，用网格线将平板分为四个相等的区域，并计算每个区域的菌落数量。为了评估构建文库的插入片段分布，随机选择了24个克隆进行检测

膜次级文库的储存容量和插入片段长度的鉴定

一个区域大约含有93个菌落，整个平板的菌落总数约为372个。根据文库容量公式（CFU/mL）=（菌落数量 / 涂布体积）× 稀释倍数以及总克隆数（CFU）= 文库容量 × 总培养体积，计算得出文库容量为3.72 × 10^7 CFU/mL，总克隆数为7.44 × 10^7 CFU（图1 A）。PCR扩增后，对2 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

讨论

鉴定病毒-宿主蛋白质相互作用对于阐明病毒感染机制和开发抗病毒策略至关重要，包括共免疫沉淀结合质谱、GST Pull-Down测定、Biolayer干涉测量、双分子荧光互补、表面等离子体共振、酵母双杂交（Y2H）系统[16]、[21]、[22]。MYTH系统是经典Y2H测定的改进版本。虽然传统的Y2H测定在细胞核内进行，不适合用于研究

结论

总之，本研究成功建立了一个功能性的膜酵母双杂交筛选系统，共鉴定出53种与红海鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白质。分子动力学模拟分析表明，病毒MCP蛋白与宿主HSC70蛋白之间的相互作用主要通过氢键和范德华力实现，结合自由能为-318.453 ± 9.007 kJ/mol。这些发现推动了相关研究的发展

CRediT作者贡献声明

陈伟超：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，方法学研究，资金获取，数据管理。于家龙：数据可视化，形式分析。何美佳：软件开发，实验研究。吴海莲：数据可视化。邱德奎：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据管理。赵超：撰写 – 审稿与编辑，指导，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（32303058）、福建省自然科学基金（2024J01434）和国家重点研发计划（2023YFD2400701）的支持。