猴痘病毒的超高灵敏度检测：利用CRISPR驱动的信号放大技术与DNA四面体介导的传感界面实现协同作用

《Biosensors and Bioelectronics》：Ultrasensitive detection of monkeypox virus: harnessing synergistic CRISPR-driven signal amplification on a DNA tetrahedron-mediated sensing interface

猴痘病毒快速检测新方法：CRISPR/Cas12a结合四棱锥DNA纳米结构实现高灵敏度电化学传感，集成智能手机便携设备可现场诊断。

　　

杜天辰|丁峰|马晓欣|罗毅|朱丹|王连辉|苏绍

南京邮电大学先进材料研究所（IAM）柔性电子国家重点实验室（LoFE）与江苏智能生物材料与诊疗技术重点实验室，中国南京文源路9号，210023

摘要

快速、超高灵敏度地检测新出现的传染病对公共卫生安全至关重要。本文开发了一种电化学生物传感器，通过结合CRISPR/Cas12a驱动的信号放大策略和基于四面体DNA纳米结构（TDN）的传感界面，实现了对猴痘病毒（MPXV）的超灵敏检测。添加的MPXV DNA能够有效激活Cas12a蛋白的切割活性，从而在TDN传感界面上介导CRISPR驱动的杂交链反应（HCR）。辣根过氧化物酶（HRP）标记的HCR产物可以催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢（H₂O₂）的反应，生成放大的电化学信号。基于这种信号变化，该CRISPR驱动的电化学生物传感器表现出与预放大CRISPR基生物传感器相当的检测性能，包括宽线性范围、超低检测限、对非目标病毒（CPXV、ETCV、VZV、HSV）的优异选择性、高重复性和良好的稳定性。通过与智能手机便携设备的集成，该设计的即时检测（POCT）电化学生物传感器能够在10%的人唾液中准确检测出MPXV。这项工作为快速、准确和现场检测传染病提供了一个有前景的传感平台。

引言

猴痘病毒（MPXV）于1958年首次从猴子体内分离出来，属于痘病毒科（Huang等人，2024年；Jeyaraman等人，2022年；Wang等人，2023年）。MPXV可感染人类，其特征性症状包括发热、肌肉疼痛和斑丘疹（Li等人，2022年；York，2022年）。截至2024年9月，全球已有超过122个国家报告了10万例MPXV感染病例和200例死亡病例。这一情况引起了全球的关注，特别是在世界卫生组织（WHO）于2022年7月确认缺乏有效治疗方法之后（Li等人，2025年）。目前，聚合酶链反应（PCR）是MPXV诊断的金标准，因其具有高准确性和灵敏度（Ladnyj等人，1972年；WHO，2024年）。然而，PCR需要实验室基础设施、专业人员和昂贵设备，这限制了其在资源匮乏地区的应用（Li等人，2010年；Maksyutov等人，2016年）。更重要的是，大多数MPXV病例发生在资源有限的地区，因此迫切需要快速、灵敏和便携的即时检测（POCT）技术。

电化学生物传感器作为一种理想的POCT传感平台，因其在操作简便性、分析速度快、成本低、灵敏度高、微型化和设备集成方面的优势而受到关注（Stefano等人，2023年）。与便携设备结合使用时，电化学生物传感器已被广泛用于传染病诊断（Wu等人，2023年）。例如，Alafeef等人开发了一种基于纸的电化学芯片，用于低成本、灵敏且特异性地检测严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）的核衣壳磷酸蛋白（N基因）。该设计的传感芯片与简单的手持读取器结合使用，可在5分钟内检测到低至6.9拷贝/μL的N基因，无需任何扩增。此外，该芯片在区分COVID-19阳性样本和阴性样本时达到了100%的准确率（Alafeef等人，2020年）。

自从Zhang等人引入CRISPR/Cas系统用于构建寨卡病毒检测生物传感器以来，基于CRISPR的生物传感器与不同方法结合使用，已被广泛用于检测核酸、蛋白质、细菌、病毒等（Feng等人，2025年；Gootenberg等人，2018年；Xu等人，2025年）。通常，许多基于CRISPR的生物传感器采用预放大步骤（如PCR、环介导等温扩增和重组酶聚合酶扩增）来提高检测性能。然而，这些预放大步骤通常会引入关键限制，包括增加污染风险、延长检测时间和需要专业设备（Xu等人，2025年；Zhou等人，2023年）。为了解决这个问题，信号放大策略已被引入到基于CRISPR的生物传感器的构建中（Liu等人，2022年；Najjar等人，2022年；Xu等人，2023年）。作为一种无需酶的信号放大技术，杂交链反应（HCR）提供了一个有前景的候选方法，可以在不复杂操作的情况下放大检测信号，实现目标分子的优异检测性能（Lv等人，2025年；Xiao等人，2025年；Zhang等人，2024年）。我们知道，传统的线性单链DNA（ssDNA）传感界面通常由于空间阻碍而限制了探针的访问性，大大限制了CRISPR切割效率和HCR放大动力学（Li等人，2020年）。为了解决这一界面挑战，使用了具有精确尺寸和纳米结构的三维刚性四面体DNA纳米结构（TDN）支架来构建高性能传感界面（Li等人，2023年）。精确的纳米结构可以有效地调节探针DNA在传感界面上的空间定位，显著提高探针的访问性和CRISPR/Cas系统的切割效率（Su等人，2021年）。

受上述进展的启发，设计了一种用于MPXV DNA检测的电化学生物传感器，结合了CRISPR/Cas系统的优势、TDN介导的传感界面和HCR信号放大。添加的MPXV DNA能够有效激活Cas12a蛋白的切割活性，从而调控HCR反应的发生。随后，在有无MPXV DNA的情况下都获得了明显的电化学信号变化。结合便携式电化学设备和手机，所设计的CRISPR介导的电化学生物传感器能够实现高效、实时和现场的MPXV DNA检测，为传染病的POCT早期诊断提供了有前景的潜力。

材料、方法和设备

所有寡核苷酸均由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）合成（表S1）。试剂和设备详见支持信息。

四面体DNA纳米结构（TDN）探针的组装

简要来说，四种单链DNA（S1-S4）与5 μL 50 mM TCEP孵育30分钟以减少二硫键。然后，在95°C下变性10分钟，并在4°C下快速退火形成TDN探针。纯化的TDN探针储存在冰箱中。

电化学生物传感器的构建

具有分层花状金纳米结构的...

该生物传感器检测MPXV的原理

如图1所示，设计了一种POCT电化学生物传感器，通过与商用电极、便携式电化学工作站和带有APP的手机结合，用于MPXV的即时检测。首先，在SPCE表面电沉积HFGNs，以增强其比表面积和导电性，从而有效提高TDN探针的负载量和电化学信号。随后，在...

结论

本研究开发了一种CRISPR驱动的电化学生物传感器，用于MPXV的检测，结合了CRISPR/Cas12a系统、TDN传感界面和基于HCR的信号放大策略。凭借SPCE-HFGNs、CRISPR/Cas系统、TDN传感界面和HCR信号放大策略的优势，所设计的生物传感器显示出宽动态范围、低检测限、快速检测速度、高重复性和优异的存储稳定性。

CRediT作者贡献声明

王连辉：监督、资源管理、项目管理和资金获取。朱丹：撰写——审稿与编辑、项目管理和概念构思。丁峰：方法学、数据分析、数据管理。杜天辰：撰写——初稿、实验研究、数据分析、概念构思。罗毅：撰写——初稿、数据可视化。马晓欣：实验研究、数据分析。苏绍：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理和资金获取。

未引用的参考文献

Xu等人，2025年。

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（62235008和62288102）、江苏省基础研究计划（BK20253006和BK20243057）、江苏省“一带一路”创新合作项目（BZ2022011）、江苏省高等学校自然科学基金（22KJA150003）、江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX25_1212）以及传感器技术国家重点实验室项目（SKT2306）的支持。