《Current Opinion in Biotechnology》：Engineering whole-cell catalysts to use plastic waste as a feedstock
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这篇综述深入探讨了利用工程化微生物作为全细胞催化剂，将塑料废物转化为原料的前沿策略。文章系统分析了当前技术面临的瓶颈，包括塑料生物利用度、酶活性优化、蛋白质分泌及底盘微生物选择等关键挑战，并展望了其在环境生物技术领域的应用潜力，为解决塑料污染这一全球性环境问题提供了创新思路。
引言：塑料困境与生物解决方案
塑料作为20世纪最具革命性的材料之一，其生产量和废弃量呈现爆炸式增长。2023年全球塑料产量达到4.138亿吨，产生3.602亿吨废弃物，预计到2040年，年塑料废弃物产生量将超过6.15亿吨。塑料的耐久性使其在自然环境中可存留数百年，从大型塑料制品到微塑料（<5 mm），对全球生态系统构成了严重威胁。
传统的机械和化学回收方法存在局限性，而生物处理技术特别是酶催化降解，为塑料废物管理提供了新思路。与体外酶解相比，全细胞催化剂具有自我维持、成本低廉的优势，不仅适用于收集塑料的处理，更有潜力用于环境中微塑料的生物修复。
微生物能否吃掉所有塑料？
经常被问及的问题是："难道不担心工程微生物逃逸到环境中吃掉所有塑料吗？"答案是否定的，这种情况在可预见的未来几乎不可能发生。根据欧盟EN13432标准，工业可生物降解塑料需要在50-60°C下6个月内失重90%。而日常生活中使用的绝大多数传统塑料具有极强的抗降解性，例如聚乙烯薄膜在自然环境中可存留数百年，主要发生物理破碎而非真正的生物降解。聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）容器在35°C下的完全解聚需要约72年，在海洋环境中50%转化为单体可能需要162年。这些数据表明，天然生物降解速率与环境标准要求之间存在巨大差距。
工程化全细胞催化剂的技术挑战
开发有效的全细胞催化剂面临多重技术壁垒，主要包括以下四个方面：
塑料生物利用度与预处理
塑料聚合物的生物降解性很大程度上取决于可水解键的可用性，这与聚合物结晶度密切相关。对于PET而言，结晶度超过30%会显著抑制酶水解，而消费后废塑料通常超过这一阈值。工业上常采用挤出和机械剪切，实验室则使用低温研磨来减小粒径、降低结晶度。然而，这些预处理方法难以应用于环境中分散的微塑料，特别是来自纺织品的高结晶度微塑料，它们通常嵌入土壤、污泥或水生系统等复杂基质中，严重限制了微生物催化剂的可及性。
塑料降解酶的优化
近年来，通过蛋白质工程、定向进化以及机器学习和人工智能策略，酶优化取得了显著进展。这些方法产生了针对PET、尼龙和聚氨酯的优化酯酶和酰胺酶，并提高了酶的耐久性和热稳定性。然而，许多优化的酶活性主要在体外最优条件下验证，且缺乏标准化比较。全细胞催化还需要考虑与细胞存活兼容的条件，如特定pH、盐度和温度。此外，蛋白质在体内最佳的特性与体外要求不同，将体外动力学转化为体内全细胞系统仍是一个瓶颈。
胞外蛋白质分泌
全细胞塑料降解的一个关键方面是酶在细胞外具有活性，这需要由产生菌分泌到胞外介质中。然而，大多数用于此目的的工程菌是革兰氏阴性菌，其分泌能力 notoriously 较低。模型生物如大肠杆菌和假单胞菌属物种被广泛使用，主要利用Sec和Tat分泌机制，但培养上清液中的酶活性有限。为应对革兰氏阴性宿主的局限性，已探索其他具有更强分泌能力的微生物，如革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌以及酵母如毕赤酵母和酿酒酵母。这些生物能分泌更大量的蛋白质，为胞外塑料降解酶的生产提供了更有效的平台。
除了分泌，其他策略也受到关注，如表面展示（酶通过融合膜蛋白锚定在细胞表面）和细胞外囊泡（可被工程化以携带酶进入环境进行塑料降解）。
整合底盘与人工群落
选择合适的微生物底盘作为全细胞催化剂至关重要。如果水解后的单体要被同化，通常选择具有该单体天然代谢途径的微生物。例如，天生具有代谢PET单体途径的细菌物种，如对苯二甲酸的丛毛单胞菌和翁松假单胞菌，或乙二醇的恶臭假单胞菌。
然而，这些微生物可能难以工程化，因此努力转向改造更易于遗传操作的菌株，如恶臭假单胞菌KT2440，其原儿茶酸降解途径已被扩展以代谢对苯二甲酸，甚至大肠杆菌也被用于将对苯二甲酸升级回收为有价值的产品，如扑热息痛、香兰素和己二酸。
另一个重要方面是任何工程菌株的进化稳定性。众所周知，重组功能在菌株部署到相关环境中时通常会被选择对抗和淘汰。克服此类限制是成功部署的关键，利用塑料作为原料可能有助于此。在这种情况下，工程生物可能被赋予选择优势。此外，进化过程将导致工程功能的微调。
除了整合菌株，人工微生物群落提供了一个有吸引力的替代方案，将专门从事不同任务的生物组合在联盟中，将减少在单一生物中观察到的代谢负担和表达挑战。在自然界中，聚合物降解发生在群落中，因此未来的努力应向天然微生物群落学习，以指导更有效的合成设计。这种工程化的劳动分工已在使用两株大肠杆菌-恶臭假单胞菌系统进行PET水解和PHA生产中得到展示，一个涉及两株恶臭假单胞菌的联盟实现了比纯培养更快、更完全的PET水解液转化。
结语：前路展望
开发用于塑料降解的稳健全细胞微生物催化剂是解决难收集塑料（特别是微塑料）环境积累的重要一步。在关键领域取得了显著进展，如酶优化和底物升级回收，但必须承认该领域主要由PET主导，而聚烯烃的研究正在出现但面临显著不同的挑战。因此，在全细胞微生物系统能够在实验室外部署之前，还有许多工作要做。
最重要的是，迄今为止的大多数努力都集中在能够在受控实验室条件下良好运作的工程微生物上。这些策略远未达到相关操作环境的要求，如污水处理厂，那里迫切需要从污泥中去除微塑料，而pH、温度、盐度和营养可用性等变量难以控制。然而，尽管已有报道能够在这些复杂条件下部分降解塑料的微生物，但它们作为进一步菌株优化的底盘仍未得到充分探索。工程化不仅能够存活而且能够在这些环境中定殖并原位表达酶的菌株，将是该领域的一个重要里程碑。
随着生物安全研究的持续，未来的应用可能会扩展到更具活力的生态系统。虽然工程微生物逃逸并降解环境中所有塑料的可能性不大，但设计具有内置保障措施的菌株以消除这种可能性仍然至关重要。最终，弥合实验室概念验证与实际部署之间的差距，不仅需要创新的微生物工程，还需要与环境、监管和社会考量仔细整合。
