《Nucleic Acids Research》：A novel dual histone mark reader ZCWPW2 regulates meiotic recombination through lactylation and transcriptional regulation in humans and mice
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本研究针对减数分裂重组调控机制不明确的难题，揭示了组蛋白双修饰阅读器ZCWPW2通过形成ZCWPW1-ZCWPW2复合物，增强LDHA/EP300介导的乳酸化修饰，从而稳定重组相关蛋白稳定性，最终保障染色体正确联会和DNA双链断裂修复。该研究不仅完善了PRDM9/ZCWPW1/ZCWPW2调控体系，还首次阐明了乳酸化修饰在减数分裂中的关键作用，为人类非梗阻性无精症提供了新的病因解释和治疗靶点。
在生命延续的奇妙旅程中，减数分裂是确保遗传多样性不可或缺的关键环节。这一精密过程中，同源染色体间发生DNA重组交换，既增加了遗传多样性，又保证了染色体的正确分离。然而，当减数分裂重组出现故障时，常常导致配子发生障碍和不育症。在大多数哺乳动物中，重组并非随机发生，而是集中在被称为"重组热点"的特定基因组区域。
多年来，科学家们已经发现PRDM9是决定重组热点位置的关键"书写器"，它通过在核小体上沉积H3K4me3和H3K36me3这两种组蛋白修饰标记来定义热点区域。随后，ZCWPW1作为"阅读器"识别这些标记，招募重组机器进行DNA双链断裂修复。然而，这一精密调控系统的具体分子机制仍不清楚，特别是是否存在其他参与者共同调控这一过程。
近期发表在《Nucleic Acids Research》的研究中，研究人员将目光投向了ZCWPW2——ZCWPW1的旁系同源物。尽管生物信息学分析提示ZCWPW2可能与PRDM9存在协同进化关系，且体外实验表明它也能结合H3K4me3和H3K36me3修饰，但ZCWPW2在体内的具体功能及其在减数分裂中的作用机制仍是未解之谜。
为了解开这一谜团，研究团队首先探究了ZCWPW2在哺乳动物生殖细胞发育中的时空表达模式。有趣的是，ZCWPW2在成年小鼠睾丸中高表达，其表达模式与PRDM9相似但与ZCWPW1的广泛表达不同。在胚胎卵巢中，ZCWPW2在E15.5天达到峰值，而在胎儿睾丸中表达量极低，但从出生后10天开始显著上升，在P20天达到峰值并稳定。染色体铺片实验进一步显示，ZCWPW2在细线期和偶线期精母细胞中均有表达，但与ZCWPW1不同，它不定位於性体并持续存在至终变期。
研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了Zcwpw2基因敲除小鼠，发现敲除小鼠雌雄均不育。雄性小鼠睾丸和附睾明显缩小，组织学分析显示精母细胞停滞并伴有凋亡。雌性小鼠卵巢中则缺乏生长卵泡，胚胎期和新生期卵巢中的原始卵泡数量显著减少。更重要的是，通过对279名非梗阻性无精症患者进行全外显子测序，发现一名近亲结婚家庭的患者携带ZCWPW2纯合移码突变，其睾丸活检显示生精小管内仅有精原细胞和精母细胞，完全缺乏精子细胞。
在机制探索方面，研究团队发现Zcwpw2缺陷精母细胞表现出严重的联会缺陷，主要表现为同源染色体不联会，同时伴有少量非同源染色体错误配对。虽然DNA双链断裂形成正常，但修复过程严重受损，导致DMC1、RAD51和RPA2等DNA修复蛋白在偶线期和粗线期样阶段异常积累。同时，MLH1和MLH3等标志交叉形成的焦点完全缺失。
通过CUT&Tag技术，研究人员揭示了ZCWPW2结合特性的独特性：在PRDM9存在的情况下，ZCWPW2在H3K4me3和H3K36me3双标记位点的富集显著增强。更重要的是，无论PRDM9存在与否，ZCWPW2都能独立结合启动子区域，调控包括ZCWPW1、EP300在内的减数分裂相关基因的转录。
免疫共沉淀-质谱分析进一步显示，ZCWPW2与ZCWPW1形成复合物，并与SYCP1、HSPA2、TEX11、MSH2、MLH1等重组相关蛋白相互作用。这种相互作用依赖于ZCWPW1，且不依赖于DNA结合。特别值得注意的是，ZCWPW1-ZCWPW2复合物与乳酸脱氢酶LDHA相互作用，并维持其酶活性。同时，ZCWPW2还通过调控组蛋白乙酰转移酶EP300的转录，共同促进重组相关蛋白的乳酸化修饰。
乳酸化组学分析显示，Zcwpw2缺陷睾丸中全局乳酸化水平显著降低，特别是在HSPA2-127K、HSPA2-129K、HSPA2-576K、SYCP1-734K、MDC1-53K等重组相关蛋白的特定位点。这些位点的乳酸化水平下降导致蛋白质稳定性降低，泛素化介导的降解增加，最终影响减数分裂重组的正常进行。
关键技术方法
研究主要应用了基因编辑技术构建Zcwpw2敲除小鼠模型，通过全外显子测序筛选人类患者突变，利用CUT&Tag分析全基因组结合位点，结合免疫共沉淀-质谱技术鉴定互作蛋白，并采用乳酸化组学全面评估蛋白质翻译后修饰变化。人类睾丸样本来自279名非梗阻性无精症患者队列。
ZCWPW2在人和小鼠减数分裂进程中不可或缺
研究人员发现ZCWPW2缺陷导致人和小鼠生殖细胞减数分裂停滞。在小鼠中，Zcwpw2敲除导致两性不育，睾丸组织显示精母细胞凋亡和发育停滞，卵巢中卵泡发育异常。在人类中，发现一名携带ZCWPW2纯合移码突变的无精症患者，其睾丸活检显示生精小管内仅有精原细胞和精母细胞，完全缺乏精子细胞。
Zcwpw2敲除小鼠表现出比Zcwpw1敲除更严重的减数分裂重组损伤
Zcwpw2缺陷精母细胞表现出严重的染色体联会异常，主要是同源染色体不联会。与Zcwpw1敲除相比，Zcwpw2敲除中每个精母细胞中不联会的染色体对数更多，表明ZCWPW2缺陷导致的联会缺陷更为严重。虽然DNA双链断裂形成正常，但修复过程受损，重组中间体MSH4和TEX11信号减少，交叉形成标志MLH1和MLH3焦点完全缺失。
ZCWPW2在PRDM9存在下富集于H3K4me3和H3K36me3位点并与ZCWPW1形成复合物
CUT&Tag分析显示，PRDM9能显著增强ZCWPW2在H3K4me3和H3K36me3双标记位点的富集。ZCWPW2与ZCWPW1形成复合物，通过各自的PWWP结构域相互作用。在PRDM9存在的情况下，大多数ZCWPW2峰与ZCWPW1峰在相同位点重叠。
ZCWPW2独立结合与减数分裂相关基因转录相关的启动子区域
无论PRDM9存在与否，ZCWPW2都能结合H3K4me3标记的启动子区域，调控减数分裂相关基因（如RAD51AP1、ZCWPW1、BARD1等）的转录。双荧光素酶报告基因实验证实ZCWPW2过表达可增强这些基因启动子活性。Zcwpw2敲除小鼠和患者睾丸中这些基因的表达均显著下调。
ZCWPW1-ZCWPW2复合物与重组相关蛋白相互作用
IP-MS分析鉴定出ZCWPW2与SYCP1、HSPA2、TEX11、MSH2、MLH1等重组相关蛋白相互作用。这些相互作用依赖于ZCWPW1，且在DNA酶处理后仍然存在，表明是直接蛋白互作。
ZCWPW1-ZCWPW2复合物相互作用并稳定乳酸脱氢酶LDHA的活性
ZCWPW2与LDHA相互作用，这种相互作用依赖于ZCWPW1。虽然ZCWPW2缺陷不影响LDHA蛋白 abundance，但显著降低其酶活性。过表达ZCWPW2可增强LDHA活性，而敲低ZCWPW1则降低其活性。
ZCWPW2缺陷睾丸中乳酸化和重组相关蛋白丰度下调
Zcwpw2敲除睾丸中全局乳酸化水平显著降低，特别是重组相关蛋白的特定位点。乳酸化水平下降导致这些蛋白稳定性降低，泛素化降解增加。乳酸化效率分析表明这种下调不是由蛋白丰度减少引起的，而是乳酸化修饰本身的选择性降低。
ZCWPW1-ZCWPW2复合物通过LDHA/EP300介导的乳酸化稳定重组相关蛋白
细胞实验证实，ZCWPW1-ZCWPW2复合物通过促进重组相关蛋白的乳酸化修饰而稳定其丰度。抑制EP300或LDHA活性会降低这些蛋白的乳酸化和丰度，而激活EP300或添加乳酸则产生相反效果。ZCWPW2缺陷细胞中这些蛋白的泛素化水平增加。
研究结论与意义
本研究系统阐明了ZCWPW2在减数分裂重组中的核心作用及其分子机制。ZCWPW2不仅作为组蛋白双修饰阅读器与ZCWPW1协同作用，还通过调控基因转录和蛋白质乳酸化修饰双重机制，确保减数分裂重组正常进行。研究发现ZCWPW1-ZCWPW2复合物与LDHA相互作用维持其酶活性，同时ZCWPW2促进EP300转录，共同介导重组相关蛋白的乳酸化修饰，从而稳定这些蛋白的丰度。
该研究的创新性在于首次将乳酸化修饰与减数分裂重组联系起来，揭示了代谢修饰在生殖细胞发育中的新功能。不仅完善了PRDM9/ZCWPW1/ZCWPW2调控网络，还为人类不育症的病因诊断提供了新的分子标记和治疗靶点。研究发现的ZCWPW2突变是人类无精症的新病因，为相关患者的遗传咨询和精准治疗提供了重要依据。
从更广泛的生物学意义来看，这项工作揭示了表观遗传调控、代谢重编程和减数分裂进程之间的精密联系，为理解生殖细胞发育的复杂调控网络提供了新视角。蛋白质乳酸化修饰在减数分裂中的重要作用提示，代谢状态可能直接影响生殖细胞基因组稳定性，这一发现对理解环境因素影响生殖健康提供了新思路。
