《Food Chemistry》：Coral-inspired
in situ immobilized lipase on covalent organic framework for efficient synthesis of flavor esters
编辑推荐：
本研究受珊瑚晶体演化启发，提出两步“缺陷预生长/结晶化”策略，在COF骨架中原位封装CaLB脂酶。通过快速形成的无定形聚合物微球吸附酶后，经动态亚胺交换反应重构结晶结构，形成保护性外壳。该生物催化剂在无水条件下酯化转化率达95.7%，循环7次后仍保持超90%活性，显著优于游离酶和商业催化剂。揭示了水在酶催化酯化中的多重关键作用。
丁胜利|王梦琪|林贵清|宋彦荣|张吉|张玉飞|郑明明
中国农业科学院油料作物研究所，脂质化学与营养湖北省重点实验室，农业部油料加工重点实验室，中国湖北武汉430062
摘要
受珊瑚自然晶体演化轨迹的启发，本研究提出了一种温和的两步“缺陷预生长/结晶”策略，用于原位将Candida antarctica脂肪酶B（CaLB）封装在共价有机框架（COFs）中。快速形成的非晶聚合物微球作为核心骨架结构。当酶吸附在其表面后，这些微球会重新结晶，从而将酶包裹并形成保护性外壳。所得的CaLB@TPB-TFPB COF-I生物催化剂与游离脂肪酶和商业产品Novozym 435相比，表现出更优异的热稳定性、有机溶剂耐受性和可重复使用性。在无水条件下，该催化剂对己酸酯的转化率达到95.7%，并且连续七次循环后仍保持90%以上的转化效率。这项工作还阐明了水在酶促酯合成中的多重关键作用。这种受珊瑚启发的封装方法利用了COFs的可调性质来提升酶的性能，为风味酯的生物催化合成提供了一种有效的解决方案。
引言
风味酯，特别是中链和短链脂肪酸酯，在自然系统中普遍存在，是天然芳香化合物的重要组成部分（Liu等人，2004年）。这些化合物被广泛应用于食品、饮料、化妆品和制药等多个行业（Lee & Trinh，2020年）。乙基己酸酯因其类似菠萝的香气而成为烈性芳香酒（尤其是白酒）中的关键风味成分（Liu等人，2024年）。近年来，对天然风味化合物的商业需求激增。传统上，风味酯是通过从天然来源提取或化学合成获得的。例如，Liang和Srzednicki（2015年）使用Likens-Nickerson装置通过蒸汽蒸馏从香蕉皮中提取异戊酸乙酯，而?ulgan等人（2020年）通过2-苯乙醇和乙酸进行反应蒸馏来合成酯类。然而，天然提取受到原材料可用性的限制。同时，脂肪酯可以通过化学合成生产，这是目前最经济的方法。但由于生产过程中的环境影响，这种方法无法产生标有“天然”标签的酯类，因此不适合大规模商业应用。
酶促生产风味酯已成为一种有前景的替代方法，因为其反应条件温和且更具可持续性（Bayout等人，2020年）。多种脂肪酶，包括Candida Antarctica脂肪酶B（CaLB）、Rhizomucor miehei脂肪酶（RML）和猪胰脂肪酶（PPL）（Ji等人，2021年），已被广泛用于合成短链羧酸酯。然而，游离脂肪酶的工业应用常常受到其固有不稳定性和较高生产成本的限制（Paul等人，2024年）。为了解决这些问题，人们广泛报道了固定化技术，以提高酶的稳定性和可重复使用性，从而增强其在工业过程中的应用性（Coelho & Orlandelli，2021年；Liu等人，2023年）。例如，De Oliveira等人（2019年）将RML共价交联到壳聚糖上，不仅提高了其活性和稳定性，还实现了92.0%的乙酸丁酯转化率。类似地，Chen等人（2025年）将脂肪酶CSL物理吸附到OMS上，实现了97.2%的肉桂酯转化率，并且可重复使用超过10次循环。这些发现表明，优化固定化策略可以显著提升脂肪酶的工业应用性。然而，还需要进一步探索固定化载体的选择和设计，以实现更高的酶负载效率和更好的催化性能。这将为风味酯的大规模生物制造提供更可靠的技术支持。
对于生物催化应用而言，支撑材料应能够实现高酶负载量，并同时促进反应物和产物在酶活性位点之间的扩散。在各种固定化策略中，吸附后方法通常将酶锚定在材料表面，这往往导致稳定性不佳和酶泄漏。虽然共价键方法可以提供稳定性，但可能会引起酶的构象变化，从而降低酶活性（Liao等人，2025年；Xiong等人，2025年）。相比之下，嵌入方法将生物实体纳入宿主基质中而不是仅将其固定在表面，从而提供更好的稳定性和保护效果。主要有两种封装策略：直接包含和原位封装。直接包含是指酶自发扩散到预先制备的多孔基质中，如介孔（氧化铝）硅酸盐、阳离子粘土矿物、金属有机框架（MOFs）和共价有机框架（COFs）（Duan等人，2025年）。这种方法简单且在酶的可及性和稳定性方面具有优势。然而，它要求宿主基质的孔径与酶的大小相匹配，并且需要保持基质内的空隙以允许反应物扩散（Cirujano & Dhakshinamoorthy，2021年；Liang等人，2019年）。原位封装是指在固定化过程中同时形成宿主基质，可以克服尺寸限制，但需要温和的条件（例如水介质、中性至微弱的pH值和适宜的温度范围）以避免酶降解。
在多孔结晶材料中，COFs作为宿主基质具有很高的吸引力，因为它们具有可调的有机结构、易于功能化、可调节的疏水/亲水平衡以及不含金属元素（Fan等人，2024年）。它们在中孔范围内的可调孔径网络也使其适合用于酶的封装。尽管利用COFs进行原位酶封装具有广阔的应用前景，并且已经取得了一些进展（Li等人，2023年；Zhang等人，2025年），但相关实例仍然有限。近年来，在开发COFs的温和合成条件方面取得了显著进展，促进了原位酶封装固定化。例如，Qiao等人（2022年）使用ZIF-90作为牺牲模板制备了用于酶固定的COF胶囊。这种方法有效降低了传质阻力并提高了酶的抗应力能力。随后，Li等人（2023年）引入了一种使用深共晶溶剂（DES）共合成COFs并原位嵌入细胞色素c（Cyt c）的策略，从而显著提高了酶对有机溶剂的耐受性。在最新的研究中，Zhang、Luo等人（2024年）采用了聚乙烯吡咯烷酮（PVP）辅助的原位固定化策略，在外消旋1-苯乙醇的动力学拆分中实现了高催化活性。在一锅法合成中，实现均匀的酶整合较为困难，因为酶扩散和框架形成的竞争过程经常导致分布不均、负载量低和酶变性等问题（Akpinar等人，2024年；Paul等人，2025年）。大自然提供了潜在解决方案的迷人蓝图。例如，珊瑚的晶体演化过程提供了宝贵的启示。新生的珊瑚虫附着在钙质骨架上，珊瑚虫分泌的矿化液促进了非晶碳酸钙快速转化为文石。当暴露在海水中时，珊瑚骨架经历溶解-重结晶过程。在地质时间尺度上，文石逐渐转化为低镁方解石，其晶体结构从菱形转变为三角形。这一自然过程展示了动态和适应性的结晶机制。类似地，COFs中可逆键的形成使得“纠错”机制成为可能，促进了自我修复和结晶。这一过程可以将酶嵌入热力学稳定且有序的晶体结构中，类似于珊瑚骨架。受这种自然生长模式的启发，可以开发出缺陷预生长、酶吸附和重结晶嵌入的策略。
在这项研究中，我们提出了一种新的两步“缺陷预生长/结晶”原位封装策略，用于在室温下将脂肪酶封装在COFs中。我们选择了广泛使用的TPB-TFPB COF（图S1）作为研究对象，使用快速形成的TPB-TFPB aCOF（非晶共价有机框架）微球作为核心骨架结构。通过将“珊瑚”酶吸附在其表面，并在特定条件下，骨架结构重新调整其晶体形态并嵌入酶，形成保护性外壳层。这种策略不仅能够在温和条件下实现酶在COF材料中的原位固定，还利用外层COF作为保护屏障来提升固定化酶的整体性能。鉴于其可控的孔结构和表面性质，这种方法有望显著提升固定化酶的整体性能。利用自然的智慧，这一过程遵循了珊瑚礁生长的自下而上的逻辑。使用合成的生物催化剂CaLB@TPB-TFPB COF-I，我们研究了其在酶促风味酯合成中的应用，并阐明了水在酯化过程中的多方面作用。这项研究为推进COF支持的原位固定化酶的研究奠定了坚实的基础。
材料
Candida antarctica脂肪酶B（CaLB）购自Amano Enzyme Inc.（日本名古屋）。胰蛋白酶购自Sunson Industry Group Co., Ltd.（中国宁夏）。比色蛋白测定试剂盒（BCA）购自上海Yuanye Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。乙酸购自National Pharmaceutical Group Chemical Reagents Co., Ltd.（中国上海）。1,3,5-三（4-氨基苯）苯（TPB）、1,3,5-三（p-甲酰苯）苯（TFPB）、乙腈（ACN）
CaLB@TPB-TFPB COF-I制备条件的优化
在这里，我们描述了一种两步策略，用于将脂肪酶封装在基于亚胺的COF微球中（方案1）。最初的缺陷预生长步骤涉及形成非晶聚合物微球（以下简称TPB-TFPB aCOF），然后将其表面吸附脂肪酶。随后的结晶步骤利用动态亚胺交换反应将非晶TPB-TFPB aCOF转化为其晶体类似物CaLB@TPB-TFPB COF-I。
结论
在这项研究中，受到珊瑚生物矿化过程的启发，我们提出了一种“缺陷预生长/结晶”策略，实现了CaLB在COFs中的原位封装。所得的生物催化剂CaLB@TPB-TFPB COF-I表现出优异的热稳定性、有机溶剂耐受性和出色的可回收性。在优化条件下，固定化酶在乙基己酸酯的合成中实现了95.7%的转化率，这是一种关键的风味酯。通过机制研究
CRediT作者贡献声明
丁胜利：撰写——原始草案、方法学、研究。
王梦琪：数据管理。
林贵清：数据管理。
宋彦荣：数据管理。
张吉：数据管理、撰写——审稿与编辑、撰写——原始草案、方法学、资金获取、概念化。
郑明明：监督、资金获取。
未引用的参考文献
Gan等人，2021年
Sicard，2023年
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32302113）、国家重点研发计划（2021YFD2100303）、中国农业科学院的农业科学技术创新项目（CAAS-ASTIP-2016-OCRI）、湖北省技术创新计划（2024BBB040）以及武汉-曙光项目（中国农业科学院油料作物研究所）的知识创新计划的支持。
