《Food Chemistry》：Structural characterization, cryoprotective potential, and mechanistic insights of thawed drip proteolytic peptides
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本研究分析解冻滴蛋白酶解多肽的结构、热滞留活性和对催化酶及热乳酸菌的保护作用，发现<3kDa肽段具有最佳保护效果，显著提升冷冻和冻干后菌体存活率，维持酶活性，SEM证实细胞结构完整，为食品冷冻保护提供新资源。
韩晓宇|曹金轩|刘世琪|王金鹏|滕文迪|李明|姚先奇|班邦·库斯万迪|巴尤·塔鲁纳·维贾贾·普特拉|王颖|张月梅
教育部北京科技商务大学老年营养与健康重点实验室，中国北京100048
摘要
本研究通过分析结构、热滞后活性以及对过氧化氢酶和嗜热链球菌的保护作用，探讨了解冻后的滴液蛋白水解肽作为冷冻保护剂的潜力。这些肽被分为三个分子量范围：>10 kDa、3–10 kDa和<3 kDa。其中<3 kDa组分具有最高的α-螺旋和β-折叠含量（合计41.87%），以及更优异的热滞后活性（3.47 °C）和过氧化氢酶残留率（81.01%），优于对照冷冻保护剂（生理盐水、蔗糖-山梨醇-甘油）。在嗜热链球菌中，<3 kDa肽显著提高了冻后存活率，冷冻后存活率为97.56%，冻干后存活率为90.89%。结果表明，<3 kDa肽在冻融过程中保持了乳酸脱氢酶和β-半乳糖苷酶的活性。扫描电子显微镜进一步证实嗜热链球菌的细胞形态完整，未受结构损伤。这些发现凸显了<3 kDa肽组分的优异冷冻保护性能，为其在冷冻食品保存中的应用提供了可能。
引言
抗冻肽（AFPs）是一类具有抗冻活性的多肽或糖肽，由多种适应寒冷环境的物种自然产生，包括某些鱼类、昆虫、植物和栖息在极地或深海环境中的微生物（Venketesh & Dayananda, 2008）。这些肽在保护细胞、组织和生物体免受低温损害方面起着关键作用。近年来，大量研究致力于探索抗冻肽的作用机制。文献报道，抗冻肽可通过氢键和其他相互作用与冰晶表面结合，从而控制冰晶的生长和重结晶（Chen, Li等人，2020）。它们还可以诱导冰晶朝特定方向生长或改变其形状，从而减少对细胞和组织的机械损伤，保持生物体的结构完整性（Chen等人，2016；Chen等人，2022）。此外，抗冻肽能够以非依数方式降低溶液的冰点而不改变其熔点，这种现象称为热滞后活性。这导致冰点与熔点之间存在差距，从而延缓了冰晶的形成和生长（Damodaran & Wang, 2017；Sidebottom等人，2000）。由于这些独特的性质，抗冻肽被认为是极好的冷冻保护剂。然而，来自这些适应寒冷环境的物种的抗冻肽的应用受到高生产成本、储存和加工过程中的稳定性问题以及食品行业监管批准的限制。因此，有必要探索其他来源的抗冻肽序列。
近年来，源自食品的抗冻肽因能有效抑制冰晶生长和保护蛋白质结构而受到广泛关注（Chen, Wu等人，2020）。目前，针对动物副产品的定向酶水解是筛选特定肽的关键方法（Graham & Davies, 2005）。Chen, Li等人（2020）报告称，从罗非鱼鳞片中提取的抗冻肽具有抗氧化和冷冻保护活性，能有效抑制冷冻和解冻引起的氧化损伤。Cao等人（2023）发现鱿鱼皮胶原蛋白水解物可减轻冰晶对冷冻虾肌肉的机械损伤。Xu等人（2024）也从大黄鱼中分离出具有抗冻活性的肽。此外，抗冻肽还被证明可以保护组织和细胞免受寒冷损伤（Baskaran等人，2021）。冷冻或真空干燥会破坏细胞壁、细胞膜和酶活性（Chen等人，2019）。Wang等人（2015）从猪皮胶原蛋白中分离出一种肽，可保护冻干的嗜热链球菌，使其存活率达到71%。从冷冻鱼糜中提取的肽也观察到了类似的保护效果（Zhai等人，2024）。这些发现表明，源自食品的抗冻肽作为天然冷冻保护剂具有巨大潜力，为冷冻食品保存提供了有前景的替代方案。
2024年，中国肉类总产量达到9770万吨，其中冷冻肉约占20%。假设平均滴液损失率为10%（Zhang & Ertbjerg, 2019），估计每年的解冻滴液产量约为195万吨。我们之前的研究表明，解冻滴液及其蛋白水解肽通过抑制绞肉在冻融过程中的肌纤维蛋白变性和聚集，表现出显著的抗冻效果（Han等人，2025；Li等人，2024）。解冻滴液蛋白水解肽来源于肉汁，通常被视为肉类加工行业的低成本副产品。将这些蛋白水解肽作为冷冻保护剂的应用将增加肉类加工废物的价值，提高经济可行性。此外，从解冻滴液中制备蛋白水解肽的过程涉及常规的酶水解和超滤技术，这些技术相对简单、可扩展，并且与现有的食品加工设施兼容。我们假设解冻滴液蛋白水解肽能够在低温条件下保护组织和细胞结构，显示出作为食品来源抗冻肽材料的巨大潜力。因此，本研究旨在评估解冻滴液蛋白水解肽的冷冻保护活性和机制。使用傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析不同分子量肽组分的二级结构和键合情况，同时使用差示扫描量热仪（DSC）评估热滞后活性。进一步评估了其在低温条件下对过氧化氢酶和嗜热链球菌的冷冻保护效果，以探讨解冻滴液蛋白水解肽作为食品来源抗冻肽的潜在应用。
材料
解冻滴液来自在2°C下解冻8小时的猪肉火腿，由浙江华通肉制品公司提供。碱性蛋白酶（酶活性为200,000 U/g）购自中国北京的Mreda公司。本研究中使用的嗜热链球菌菌株来自BioDee生物技术有限公司。本研究使用的培养基为青岛Hope生物技术有限公司的M17肉汤。所有培养基均经过高压灭菌处理。实验中使用的试剂...
分子质量分布
如图1A所示，对猪肉解冻滴液进行酶水解后得到了三个分子量（MW）组分：MW > 10 kDa的肽占14.53%，3–10 kDa的肽占12.55%，MW < 3 kDa的肽占大部分，占比72.94%。先前的研究发现，MW < 3 kDa的肽具有良好的抗冻活性（Wu等人，2018）。Chen等人（2019）报告称，分子量在600–2700 Da范围内的肽具有抗冻活性...
结论
本研究分析了三种不同分子量的解冻滴液蛋白水解肽对过氧化氢酶和嗜热链球菌的结构、热滞后活性（THA）和冷冻保护效果。结果表明，<3 kDa肽组分具有稳定的二级结构、较高的热滞后活性，并对过氧化氢酶活性具有显著的冷冻保护作用。在冷冻和冻干处理过程中，<3 kDa肽显著提高了嗜热链球菌的存活率。
CRediT作者贡献声明
韩晓宇：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、概念构建。曹金轩：项目管理、资金获取、概念构建。刘世琪：资源协调、资金获取、数据分析。王金鹏：资源协调、资金获取、数据分析。滕文迪：实验设计、数据分析、概念构建。李明：资源协调、实验设计、数据分析。姚先奇：数据验证、资源提供。班邦·库斯万迪：撰写、审稿...
未引用参考文献
Chen等人，2020
Jiang等人，2022
Wang和Damodaran，2009
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了北京自然科学基金（编号2252004）和国家自然科学基金（编号32201945）的支持。
