《Food Chemistry》：Interactions and binding mechanisms of soy protein isolate with theasinensin a in different pH conditions by multi-spectroscopy analysis and molecular docking
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本研究首次探究了不同pH（4.5、7.0、9.5）下SPI与茶多酚二聚体TSA的相互作用机制，通过UV-Vis、荧光光谱及分子对接等技术，发现pH显著改变SPI微环境，氢键主导结合，并揭示pH通过调控色氨酸和酪氨酸残基影响结合动力学，为开发SPI-TSA复合物提供理论依据。
张浩宇|徐伟奇|王玉露|范霞|郭千坤|刘洪军|敖家璐|孙天津|穆罕默德·阿比德|曾晓雄
南京农业大学食品科学与技术学院，中国江苏省南京市210095
摘要
大豆蛋白分离物（SPI）可能与多酚发生相互作用，但pH值会影响这种相互作用。茶素苷A（TSA）是表没食子儿茶素没食子酸酯的二聚体，具有增强的功能特性，而其与SPI的结合却鲜有关注。因此，本研究首次探讨了在不同pH值（4.5、7.0和9.5）下它们的相互作用。紫外-可见光吸收光谱结果表明，这种结合改变了SPI的微观环境。荧光实验显示，在pH 9.5时Ka值最高（3.92×106 L/mol），且猝灭机制主要是静态的。在不同pH值下，氢键起着关键作用。结合后，SPI的二级结构发生了变化：在pH 4.5时α-螺旋含量从6.31%增加到8.75%，而在pH 7.0时从6.16%增加到7.78%。分子对接实验证实了它们之间存在相互作用。本研究为SPI-TSA复合物的应用提供了理论基础。
引言
大豆的主要活性成分之一是大豆蛋白分离物（SPI），由于其高营养价值、良好的加工性能和低成本，在食品工业中得到广泛应用。然而，SPI的许多有用特性（如起泡性、乳化性和抗氧化活性）容易受到其结构和组成的影响，这限制了其应用范围（Cheng等人，2020年）。为了扩大其在食品中的应用，需要进一步改善SPI的功能特性。多酚可以与SPI形成共价或非共价复合物，从而改变蛋白质的结构和/或功能（Chen等人，2015年）。Dai等人（2024年）研究了SPI与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）之间的相互作用，发现两者主要通过氢键和疏水力连接。Guo等人（2021年）还研究了鞣酸与SPI在碱性条件下的相互作用，发现这种组合可以改善SPI的功能特性。
多种因素（如pH值、温度和孵育时间）会显著影响蛋白质-多酚的相互作用。这些因素决定了键的形成，进而影响蛋白质的功能特性。其中，pH值是最重要的因素之一，但往往被忽视。研究表明，pH值会影响蛋白质的功能特性以及其与多酚的相互作用（Sun、Liang等人，2025年；Wang等人，2020年）。例如，Yang等人（2020年）研究了EGCG与β-球蛋白（7S）和甘氨酸蛋白（11S）在不同pH条件下的相互作用，发现pH值是决定性的因素。Zhang等人（2017年）发现，EGCG猝灭β-乳球蛋白荧光的能力随pH值的升高而降低。这些结果清楚地表明，蛋白质-多酚的相互作用会受到pH值的影响。
茶多酚中的一类化合物——茶素苷（TSs）首次在乌龙茶中被发现，它们是由儿茶素B环上的C-C键氧化形成的二聚体。茶素苷A（TSA）是茶中的主要TSs，主要存在于乌龙茶和红茶等发酵茶中（Xu等人，2023年）。已有研究表明，TSA具有比单宁更强的药理活性，如抗炎、抗癌和抗氧化作用，因此是一种有前景的食品成分（Isaacs等人，2011年；Xu等人，2023年）。多项研究表明，SPI与多酚的相互作用模式高度依赖于多酚的结构（Ao等人，2021年）。因此，可以推测TSA能与SPI上暴露的结合位点更广泛地结合。这种结构特征可能使TSA在其他儿茶素共存时被SPI特异性识别，其中氢键和疏水相互作用起主导作用（Li等人，2023年）。因此，SPI可能对含有联苯结构的二聚体儿茶素具有更高的亲和力，这一独特结构特征使TSA在与蛋白质结合时具有更强的能力，从而更有效地形成蛋白质-多酚复合物。尽管许多研究证明了儿茶素与蛋白质的结合及其增强的功能效果（Dai等人，2024年；Kim等人，2024年），但TSA与SPI的相互作用却鲜有关注。TSA具有优越的功能特性和结构特点，有助于改善蛋白质-多酚复合物中常见的问题，如结合效率低和蛋白质功能改善不足。因此，研究TSA与SPI在不同pH值下的相互作用及其潜在机制具有重要意义。通常使用电泳、色谱和光谱等技术来表征SPI，这些方法有助于分析其结构变化。然而，这些方法往往无法全面理解不同条件下蛋白质-多酚相互作用的分子机制。因此，本研究探讨了SPI与TSA在pH值（4.5、7.0和9.5）结合后的浊度、粒径和表面疏水性的变化，并通过紫外-可见光（UV-Vis）吸收光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和圆二色性（CD）光谱研究了相互作用机制。结合分子对接模拟，还研究了TSA与SPI在常规条件下的结合力、结合能和关键氨基酸残基，为SPI-TSA复合物在食品领域的广泛应用提供了理论基础。
材料
97%）由南京农业大学食品科学与技术学院实验室制备。SPI（蛋白质含量≥90%）购自上海瑞昂生物科技有限公司（中国上海）。所有用于色谱的溶剂均为高效液相色谱（HPLC）级。除非另有说明，否则所有其他试剂均为分析试剂级。
TSA的制备
TSA的制备方法参考了Tao等人的报告（Tao等人，2020年）。
浊度
浊度分析是确定溶液中粒径变化的有效方法。通过监测这些变化可以了解蛋白质-多酚复合物的形成情况，并根据浊度水平估计结合能力。由于TSA浓度在不同pH值下没有明显变化，且TSA在600 nm处的吸光值非常低，因此可以忽略TSA引起的浊度变化。
结论
本研究系统地阐明了SPI-TSA复合物在一系列pH值（4.5、7.0和9.5）下的形成机制。关键发现是pH值通过改变Trp和Tyr残基的微观环境，从而调节了结合亲和力和结合力。本研究的主要创新在于建立了pH诱导的蛋白质构象变化与结合动力学之间的结构-活性关系。
CRediT作者贡献声明
张浩宇：撰写——初稿、软件使用、方法设计、实验研究、数据分析。
徐伟奇：方法设计、实验研究、数据分析。
王玉露：实验研究。
范霞：实验研究。
郭千坤：实验研究。
刘洪军：资源提供、实验研究。
敖家璐：实验研究。
孙天津：实验研究。
穆罕默德·阿比德：撰写——初稿、实验研究。
曾晓雄：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金争取、概念构思。
资助
本研究得到了江苏省关键技术研发计划（BE2020341）和江苏省高等教育机构优先学术发展计划的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
