《Food Chemistry: X》：Combining bioaffinity-ultrafiltration with
in vivo and
in vitro analyses to identify and characterize α-glucosidase inhibitors from
Rosa roxburghii Tratt. Fruit
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本研究针对糖尿病管理中合成α-葡萄糖苷酶抑制剂的副作用问题，研究人员开展了从刺梨果实中筛选和表征天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的主题研究。通过亲和超滤-UPLC-Orbitrap MS/MS技术鉴定出30种化合物，其中槲皮素、木犀草素等四种黄酮类化合物表现出显著抑制活性。研究揭示了其通过氢键和范德华力结合酶活性位点、改变酶构象的抑制机制，并通过体内实验证实其有效降低餐后血糖、改善脂代谢紊乱。该研究为开发刺梨作为辅助糖尿病管理的功能性食品提供了科学依据。
糖尿病，特别是2型糖尿病，已成为全球性的重大公共卫生挑战，其典型特征之一是餐后高血糖。控制餐后血糖对于糖尿病管理至关重要，而α-葡萄糖苷酶作为肠道中负责碳水化合物分解的关键酶，是控制餐后血糖的重要靶点。目前临床使用的合成α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖，虽然有效，但常伴随胃肠道不适等副作用，限制了其长期应用。因此，从天然产物中寻找高效、低毒的α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为当前研究的热点。
刺梨，学名Rosa roxburghii Tratt.，是主要产于中国贵州省的一种特色水果，富含多酚类和黄酮类化合物，传统上被认为具有多种保健功效。前期研究虽提示刺梨及其果汁具有降血糖效果，但其具体活性成分及作用机制尚不明确。发表在《Food Chemistry: X》上的这项研究，正是为了系统阐明刺梨果实中发挥α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分及其作用机制，为开发基于刺梨的降血糖功能性食品提供理论依据。
为开展此项研究，研究人员采用了多项关键技术方法。首先，通过65%乙醇提取刺梨果实获得粗提物。核心筛选技术是生物亲和超滤与超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术，用于从复杂提取物中快速筛选并鉴定出与α-葡萄糖苷酶特异性结合的活性成分。在机制研究方面，运用了酶动力学分析以确定抑制剂的抑制类型和常数；通过荧光猝灭、同步荧光、三维荧光光谱以及圆二色谱技术，深入探究了活性小分子与α-葡萄糖苷酶相互作用后对酶蛋白微观环境、构象及二级结构的影响；并利用等温滴定量热法获取结合过程的热力学参数，同时通过分子 docking 模拟化合物与酶活性口袋的结合模式。体内验证部分，研究构建了2型糖尿病小鼠模型，通过口服蔗糖耐量试验评估活性成分的降餐后血糖效果，并进行了为期8周的长期给药实验，观察对血糖、血脂代谢及相关组织病理变化的影响。
3.1. 刺梨果实对餐后高血糖的影响
通过昆明小鼠的口服葡萄糖耐量试验发现，给予65%乙醇刺梨提取物的小鼠，其餐后血糖曲线下面积显著低于对照组，且效果优于阿卡波糖组，表明刺梨提取物具有调节餐后血糖的潜力。
3.2. 刺梨果实提取物中生物活性成分分析
采用亲和超滤-UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS技术，从刺梨提取物中成功鉴定出30种与α-葡萄糖苷酶具有潜在结合能力的化合物，其中包括腺苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素、芹菜素、杜荆素等。
3.3. α-葡萄糖苷酶抑制活性研究
对12种商业化标准品进行体外抑制活性验证。结果显示，槲皮素(IC50= 4.80 ± 0.12 μg/mL)、木犀草素(IC50= 17.51 ± 0.27 μg/mL)、芹菜素(IC50= 33.24 ± 0.32 μg/mL)和杜荆素(IC50= 52.62 ± 0.26 μg/mL)的抑制活性均强于阳性药阿卡波糖(IC50= 156.90 ± 6.00 μg/mL)。棕榈酸也显示出较强的抑制活性(IC50= 25.71 ± 0.24 μg/mL)。
3.4. 四种黄酮类化合物的抑制类型
通过酶动力学分析确定槲皮素、木犀草素和杜荆素对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为混合型抑制，而芹菜素为非竞争性抑制。这表明四种黄酮类化合物均为可逆抑制剂，主要通过结合酶分子影响其催化功能。
3.5. 荧光猝灭研究
荧光猝灭实验表明，四种黄酮类化合物均能有效猝灭α-葡萄糖苷酶的内源荧光，且猝灭常数Kq值均在1012数量级，远大于动态猝灭的扩散控制常数，表明其与酶的结合形成了基态复合物，属于静态猝灭机制。结合常数Ka和结合位点数n表明它们与酶以1:1的比例结合，结合能力强弱顺序为槲皮素 > 芹菜素 > 木犀草素 > 杜荆素。
3.6. 同步荧光光谱
在Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm的同步荧光光谱中，随着四种黄酮类化合物的加入，酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均发生猝灭，且最大发射波长发生蓝移或红移，表明化合物与酶的相互作用改变了酪氨酸和色氨酸残基周围的微环境，疏水性增强。
3.7. 三维荧光光谱分析
三维荧光光谱显示，加入四种黄酮类化合物后，α-葡萄糖苷酶的荧光峰1和峰2的强度均显著降低。峰1的强度下降表明色氨酸和酪氨酸残基的微环境发生改变；峰2的强度下降则反映了酶肽链骨架结构的构象发生了变化，表明酶蛋白发生了部分去折叠。
3.8. 圆二色谱分析
远紫外圆二色谱结果显示，α-葡萄糖苷酶在209 nm和220 nm处呈现典型的α-螺旋负峰。加入四种黄酮类化合物后，峰强度绝对值减小，但谱图形状未发生明显变化，说明化合物的结合引起了酶二级结构的改变，表现为α-螺旋含量减少，β-折叠含量增加，这种构象变化可能阻碍底物与酶活性中心的结合，从而导致酶活性受到抑制。
3.9. 等温滴定量热法分析
ITC结果显示，四种黄酮类化合物与α-葡萄糖苷酶的结合过程均是自发、放热的。滴定曲线均呈现单次拐点，提示存在单一类别的结合位点。结合亲和力顺序与抑制活性强弱基本一致，槲皮素表现出最高的结合亲和力。
3.10. 分子对接
分子对接模拟揭示了四种黄酮类化合物与α-葡萄糖苷酶(PDB ID: 5NN8)活性口袋的具体结合模式。它们主要通过氢键、范德华力、π-π堆叠、π-烷基等相互作用与酶活性中心的关键氨基酸残基结合，如ASP 282、ASP 518、ASP 616、ARG 281等。羟基数量的多少可能影响其抑制活性，槲皮素具有较多的羟基，形成了更多的氢键，这可能是其抑制活性最强的结构基础。
3.11. 口服蔗糖耐量试验
在2型糖尿病模型小鼠中进行的口服蔗糖耐量试验表明，与模型组相比，槲皮素、杜荆素、木犀草素和芹菜素均能显著降低餐后血糖水平及其曲线下面积，其中芹菜素组显示出最佳的降糖效果，其AUC值最低。
3.12. 血清脂质水平及病理切片分析
长期给予芹菜素能显著降低2型糖尿病小鼠的体重。虽然其对空腹血糖的改善与阿卡波糖组相比无统计学差异，但能显著改善胰岛素抵抗。在血脂代谢方面，芹菜素能有效降低血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，同时升高高密度脂蛋白胆固醇水平，表明其具有改善脂代谢紊乱的作用。肝脏、肾脏和脂肪组织的病理切片结果显示，芹菜素干预可减轻糖尿病引起的组织病变程度。
本研究系统地从刺梨果实中筛选并鉴定出多种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的黄酮类化合物，其中槲皮素、木犀草素、芹菜素和杜荆素的体外抑制活性均优于临床药物阿卡波糖。研究从酶动力学、光谱学、热力学及计算机模拟等多个层面深入揭示了这些活性成分与α-葡萄糖苷酶的相互作用机制，证实它们通过可逆地结合酶分子，诱发其构象变化，从而抑制酶活性。体内实验进一步验证了其良好的降餐后血糖效果，并且长期应用芹菜素还能改善2型糖尿病伴随的脂代谢紊乱和胰岛素抵抗，对重要器官具有保护作用。
该研究的意义在于，不仅明确了刺梨果实降血糖的药效物质基础，还深入阐释了其作用机制，为将刺梨开发成为辅助管理2型糖尿病的功能性食品或天然药物提供了坚实的科学依据。研究中所采用的亲和超滤与高分辨质谱联用的筛选策略，也为快速发现天然产物中的活性成分提供了有效方法。未来，对刺梨中这些活性成分的深入开发利用，有望为糖尿病患者提供一种新的、更安全的饮食干预选择。
