模拟大肠杆菌K12对PEF的基因依赖性抗性

《Food Microbiology》：Modelling Gene-Dependent PEF Resistance of E. coli K12

脉冲电场杀菌机制研究显示，pH7.0和总能量影响大肠杆菌K12灭活动力学，发现rpoS调控网络与clpB、dnaK、recA等基因参与应激响应。

　　

Fotios Lytras | Georgios Psakis | Ruben Gatt | Javier Raso | Vasilis Valdramidis

马耳他大学，健康科学学院，食品科学与营养系，MSD 2080，马耳他

摘要

本研究通过评估22种大肠杆菌K12突变体的抗性，探讨了脉冲电场（PEF）的抗菌机制。在PEF处理条件下（23 kV/cm，53.3 μs，95.4 kJ/kg，pH 7.0），初步筛选发现ΔclpB、ΔrpoS和ΔdnaK的敏感性增加（p < 0.05）。进一步对8种选定的菌株在pH 7.0和4.0条件下的灭活动力学进行分析，发现其表现出非线性、多阶段的行为。这一现象通过结合对数线性初级模型和二阶多项式模型的全局建模方法进行描述，该模型将处理时间、总特定能量和存活数据作为变量。计算出的模型参数（C1、C2和C3）在pH 7.0条件下各菌株之间存在显著差异（p<0.05），而在pH 4.0条件下则没有差异。此外，计算出的灭活速率kmax随总特定能量的变化而变化：在pH 7.0条件下，kmax在低（0-40 kJ/kg）和高（140-180 kJ/kg）总特定能量时有所不同；而在pH 4.0条件下，kmax在高总特定能量（120-160 kJ/kg）时升高。总之，大肠杆菌对PEF的反应依赖于应激调节因子rpoS，这一反应还涉及编码分子伴侣蛋白（如dnaK、clpB和recA）的基因，这些蛋白与DNA修复相关。研究表明，PEF的抗性受pH值和总特定能量的影响，表明大肠杆菌对PEF处理表现出多方面的响应，为食品安全的微生物灭活策略提供了依据。

引言

大肠杆菌是一种革兰氏阴性、不产生孢子的杆状细菌（Khan, Gupta和Sekhri, 2021）。作为肠杆菌科的一员，它是人类和温血动物胃肠道中最常见的共生菌之一，与宿主保持互利共生关系，很少引起疾病（Allocati等人, 2013）。野生动物、家畜和人类偶尔可能携带致病性大肠杆菌（如产志贺毒素的大肠杆菌O157:H7），这些细菌可能污染肉类和农作物（美国食品药品监督管理局, 2020）。例如，在欧洲，欧洲食品安全局（EFSA）报告了一起与新鲜沙拉蔬菜相关的产志贺毒素大肠杆菌（STEC O104:H4）的暴发（EFSA, 2011）。而在美国，也报道了多种食品产品中大肠杆菌（STEC O157:H7）的暴发，包括叶类蔬菜、豆芽、生奶酪、生牛肉和家禽（美国食品药品监督管理局, 2019）。

总体而言，大肠杆菌能够适应各种环境压力，并在感染期间在宿主体内存活（Abdelwahed等人, 2022）。在压力条件下，细菌的反应网络可以检测、响应并适应各种化学和物理挑战，包括pH值变化、温度变化、营养缺乏和氧化应激（Abdelwahed等人, 2022）。在大肠杆菌中，主要的应激调节因子是Rpos，它在多种压力条件下被激活，包括氧化应激、高渗压、紫外线辐射、高温和乙醇（Hengge-Aronis, 2002；Battesti, Majdalani和Gottesman, 2011）。Rpos也称为σS，是RNA聚合酶的一个亚基，在多种压力条件下可以替代σ70（RPOD），后者是负责转录与细胞基本功能相关基因的主要sigma因子（Hengge-Aronis, 2002）。在其他压力条件下，其他调节因子也可能发挥作用，例如在氧化应激下，OxyR被激活，导致40个基因的表达，以保护细胞免受过氧化氢的毒性（Chiang和Schellhorn, 2012）。此外，soxRS调控子在大肠杆菌中也起着重要作用，它由SoxR和SoxS调节因子通过两阶段调控网络系统表达，对有机化合物、抗生素、一氧化氮自由基和重金属的抵抗力具有重要意义（Semchyshyn, Bagnyukova和Lushchak, 2005）。此外，根据压力的不同，还存在其他机制，如热休克蛋白（即分子伴侣蛋白和蛋白酶），它们帮助细胞适应环境和代谢变化，包括由DnaK、DnaJ和GroE组成的DnaK和GroE伴侣系统以及GroEL和GroES（Arsène, Tomoyasu和Bukau, 2000）。

目前，工业界和研究的重点是将热处理替换为创新技术，包括脉冲电场（PEF）、超声波（US）、脉冲光（PL）、冷大气等离子体（CAP）、紫外线和臭氧，目的是在提高和保持食品质量的同时确保食品安全（White等人, 2025）。PEF技术是一种新兴的微生物灭活方法，利用持续时间极短（从微秒到毫秒）的高电压电脉冲，电场强度在15至40 kV/cm之间，以实现有效的去污效果（Raso等人, 2016）。人们认为PEF的主要作用机制基于电穿孔（或电渗透）现象，即电场作用于微生物细胞会导致膜通透性增加（Coster和Zimmermann, 1975；Heinz等人, 2001；Manías和Pagán, 2005）。此外，产生电场所需的特定能量的增加会通过焦耳（欧姆）加热提高处理介质的温度，这种温度升高通过促进更有效的微生物灭活来增强PEF的效果（Salda?a, Puértolas, álvarez等人, 2010）。脉冲电场（PEF）处理引起的电穿孔结果在很大程度上取决于具体的处理参数，所施加的电场强度决定了微生物细胞膜的破坏是暂时的和可逆的，从而允许细胞恢复，还是导致不可逆的损伤，可能导致细胞死亡（Weaver和Chizmadzhev, 1996；Jaeger等人, 2009）。此外，PEF技术用于微生物灭活的效果取决于多种因素，包括微生物特性（种类、菌株以及大小和形状）、生长阶段、环境条件（pH值、导电性和水分活度）和处理参数（电场强度、处理时间和总特定能量）（Raso等人, 2016；Lytras, Psakis, Gatt, Cebrián等人, 2024）。PEF处理后的微生物细胞死亡是由于膜通透性增加导致的细胞内物质泄漏、膜结构改变以及渗透效应或膨胀效应（Min, Evrendilek和Zhang, 2007；Golberg, Fischer和Rubinsky, 2010）。在工业上，PEF技术已被批准用于果汁的商业巴氏杀菌，要求至少减少5-log10的最耐受性食源性病原体（美国食品药品监督管理局, 2000）。

在温度波动和渗透压变化等环境压力下，膜脂质的组织和结构可能会发生变化，进而调节各种细胞活动（Los和Murata, 2004）。PEF处理后，细胞恢复是一个复杂的过程，需要复杂的细胞机制来恢复膜完整性和恢复正常功能（Batista Napotnik, Polaj?er和Miklav?i?, 2021）。PEF处理前后基因表达的变化和蛋白质合成的差异可以为阐明PEF对微生物的灭活和抗性机制提供有用信息。不同的研究报道了多种可能有助于微生物抵抗PEF的机制，包括参与膜功能和运输的蛋白质合成改变、膜修复能力的增强、对氧化应激的适应以及细胞能量代谢的变化（Lytras, Psakis, Gatt, Cebrián等人, 2024）。然而，尽管取得了这些进展，驱动微生物抵抗PEF的主要机制仍不完全清楚。

准确的数学预测模型对于设计有效的PEF处理至关重要（álvarez等人, 2003）。这些数学预测模型将各种PEF处理参数与存活率相关联，以估计微生物的灭活程度（Singh等人, 2017）。存活曲线通常在低Log10减少时遵循一级对数线性模式，但当曲线偏离这种行为时，需要使用替代的数学预测模型（Rivas等人, 2006）。先前的研究采用了多种模型来描述大肠杆菌菌株对PEF处理的灭活数据，包括一级动力学模型（Amiali等人, 2007）、Arrhenius模型（Alkhafaji和Farid, 2008）、Bigelow模型（Rivas等人, 2006）、Hülsheger模型（Rivas等人, 2006）、Weibull模型（Rivas等人, 2006）和二次响应模型（Mosqueda-Melgar, Raybaudi-Massilia和Martín-Belloso, 2007；Salda?a等人, 2011）。

本研究旨在使用全局建模方法对大肠杆菌K12在PEF下的微生物灭活动力学进行全面分析。具体目标是表征和比较大肠杆菌K12及其选定的同源突变体在PEF处理下的灭活动力学模式和微生物减少情况，特别关注菌株对PEF抗性的差异。在不同环境条件下评估灭活动力学，包括两种pH值，以评估遗传背景和物理化学因素对微生物敏感性的影响。通过将动力学建模与比较菌株分析相结合，本研究深入探讨了PEF抗性的微生物机制，并支持进一步优化PEF处理方法，无论是单独使用还是与其他保存方法结合使用。

部分摘录

菌株、培养基和培养条件

所使用的细菌菌株为大肠杆菌K12 BW25113野生型（基因型：Δ(araD-araB)567 ΔlacZ4787::rrnB-3 λ- rph-1 Δ(rhaD-rhaB)568 hsdR514），其完整基因组序列已存入GenBank，登录号为CP009273.1），以及其22种同源突变体（ΔclpB、ΔrpoS、ΔrecA、ΔleuO、ΔrmpF、ΔdnaK、ΔompT、ΔcadC、ΔoxyR、ΔbetI、ΔsoxS、ΔkatG、ΔsdhC、ΔtrxC、ΔnudE、ΔappY、ΔcbI、ΔcspD、ΔtktB、ΔpstB、ΔoppB、ΔcyoA）（表1）。所有菌株均来自国家生物资源项目

结果

本研究探讨了大肠杆菌K12在脉冲电场（PEF）处理下的机制响应。有意使用连续处理系统来模拟工业应用。研究重点是比较大肠杆菌K12的同源突变体与野生型，以更好地了解它们对PEF处理的响应，并识别可能对适应PEF诱导的压力至关重要的基因。

讨论

本研究强调了pH值和PEF强度是影响大肠杆菌菌株行为及其随后微生物灭活率的主要关键因素。一般来说，早期的PEF处理研究观察到存活曲线呈线性关系（Heinz等人, 1999；Reina等人, 1998）。然而，这可能与灭活水平较低（< 4.0 Log10）有关，这种情况仅发生在PEF处理强度较低时

结论

总之，本研究探讨了大肠杆菌K12及其同源突变体在pH 7.0和4.0条件下对PEF处理的机制响应。首先，在PEF处理（23 kV/cm，53.3 μs，95.4 kJ/kg，42.8°C）下对22种突变体进行了初步筛选，其中3种突变体（ΔclpB、ΔrpoS、ΔdnaK）在Log10减少方面与野生型相比存在统计学差异（p ≤ 0.01）。除了这些突变体外，还有三种同样敏感的突变体，即ΔrecA、ΔleuO、ΔrmpF，以及另一种

CRediT作者贡献声明

Vasilis Valdramidis：写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法论、资金获取、概念构思。Fotios Lytras：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法论、研究实施、数据管理、概念构思。Ruben Gatt：写作 – 审稿与编辑、监督、资金获取。Javier Raso：写作 – 审稿与编辑。Georgios Psakis：写作 – 审稿与编辑、监督

未引用参考文献

Arsène等人, 2000; Batista Napotnik等人, 2021; Battesti等人, 2011; Bouillet等人, 2024; Chung等人, 2006; Geeraerd等人, 2005; Golberg等人, 2010; Khan等人, 2021; Lytras等人, 2024; Min等人, 2007; Mosqueda-Melgar等人, 2007; Peter等人, 2000; Paul Wright, 1992; Salda?a等人, 2010; Semchyshyn等人, 2005.

数据可用性

本文的数据可在文章中找到。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

资助

该项目获得了欧盟“地平线2020”研究和创新计划的资助，依据Marie Sk?odowska-Curie资助协议编号955431。

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致谢

作者感谢英国雷丁大学的Kimon-Andreas Karatzas教授提供他们收藏的大肠杆菌K12及其突变体。