阐明大豆蛋白的纤维形成与降解过程：识别纤维形成区域并深入了解其自组装机制

《Food Hydrocolloids》：Elucidating the fibril formation and degradation process of soy protein: identification of fibril-forming regions and insights into the self-assembly mechanism

大豆蛋白纳米纤维（SPNFs）的72小时形成与降解过程表明，0-24小时为形成阶段，小肽通过自组装形成纤维，β-折叠含量增加，纤维长度达250纳米；>24小时进入降解阶段，氢键断裂导致非核心区域脱落，核心区域聚集。通过SDS-PAGE、Th T荧光、AFM、FTIR及TIMS-TOF-MS分析，鉴定出190个纤维形成肽，其中104个为核心肽（低电荷、高疏水性）。7S亚基纤维核心区域占比高于11S亚基，分子动力学模拟显示β-折叠残基和氢键网络随时间增强，揭示纤维形成机制。

　　

赵赫凯|黄玉阳|齐宝坤|李阳

中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学食品科学学院，邮编150030

摘要

植物蛋白纤维在食品加工和新材料开发中显示出越来越大的潜力。理解其纤维化机制，特别是通过识别纤维形成区域，在可控的结构设计中至关重要。本研究将大豆蛋白的纤维化过程分为形成阶段（0–24小时）和降解阶段（>24小时），重点关注纤维形成区域的组装和识别。SDS-PAGE分析显示，在最初的12小时内，小肽迅速从亚基中释放出来；而Th T荧光实验表明有一个非常短的滞后阶段（0.15小时），并且纤维生长速率为0.36 FU/h^-1。原子力显微镜（AFM）成像显示，在形成期间，纤维的轮廓长度在24小时时增加到约250纳米，同时柔韧性逐渐增强，β-折叠片含量也有所增加。长时间孵育会破坏分子间的氢键，导致非核心区域脱落和纤维核心聚集。TIMS-TOF-MS鉴定出190种纤维形成肽，其中包括104种具有低净电荷和高疏水性的核心肽。与11S相比，7S中的纤维核心区域覆盖率更高，并且在纤维形成肽中占更大比例。分子动力学模拟显示，代表性纤维核心肽系统的β-残基、β-折叠片含量和肽间氢键随时间增加，表明其具有明显的纤维化倾向。本研究系统地阐明了大豆蛋白纳米纤维的自组装过程，为它们的结构调控和功能设计提供了理论基础。

引言

自1968年Eanes和Glenner发现并命名淀粉样蛋白以来，人们对病理性和功能性淀粉样纤维的理解取得了显著进展，这激发了从食品蛋白中设计人工淀粉样纤维的创新（Ke等人，2020年）。尽管几乎所有蛋白质都至少包含一个能够形成纤维的自我互补短序列，但可访问的易纤维化区域主要埋藏在它们的天然构象中（Cao & Mezzenga，2019年）。体外实验中，常使用酸热处理来诱导蛋白质展开和水解，从而暴露出易纤维化区域，这些区域会自组装成人工淀粉样纤维。由于人工淀粉样纤维具有高长宽比、丰富的表面基团和优异的机械强度，它们在生物材料、食品加工和环境工程领域展现出巨大的应用潜力（Meng, Wei, & Xue，2022年）。因此，蛋白质纤维化被认为是一种有效的修饰策略，可以增强食品来源蛋白质的功能特性并扩大其应用范围。

在原子水平上，尽管形态多样，所有蛋白质纤维都具有特征性的跨β结构，其中β-折叠片平行于纤维轴排列，β-链垂直定向。高长宽比的纤维轴由一个高度有序的结构——纤维核心构成，决定了纤维的机械性能（Wang等人，2023年）。围绕纤维核心的是一个“模糊层”，也称为“侧翼区域”，它由内在无序的结构组成，这些结构调节纤维的机械性能、粘附性和分子结合能力（Larsen等人，2025年）。因此，蛋白质序列通常可以分为包含纤维核心和非核心区域的纤维形成区域，以及非纤维区域。纤维化动力学、纤维形态和稳定性与原始蛋白质的序列特性以及这些纤维形成区域的特定组成密切相关（Vahedifar & Wu，2022年）。Housmans等人（2022年）证明，全长卵白蛋白形成卷曲的纤维，而仅分离出的纤维核心区域则产生直纤维。此外，Frey等人（2024年）的研究表明，溶菌酶纤维的可逆性不仅取决于溶菌酶单体的展开状态，还与核心区域中β-折叠片的长度和数量密切相关。因此，识别和表征纤维形成区域对于阐明自组装机制和指导人工蛋白质纤维的合理设计至关重要。

近年来，由于对可持续性、绿色技术和健康的兴趣日益增长，关于来自谷物、豆类、坚果和种子的植物蛋白纤维化的研究有所加强（Kutzli, Zhou, Li, Baier, & Mezzenga, 2023; Li等人，2021; Liang等人，2024; Zhou等人，2022）。作为高质量植物蛋白的代表，大豆蛋白具有广泛的可用性、低成本和平衡的氨基酸组成。其高含量的酸性氨基酸赋予了它显著的自我组装和纤维化能力。虽然少量纤维核心可能在胃肠道消化后进入系统循环，但越来越多的研究表明食品来源的蛋白质纤维具有可靠的生物安全性（Xu等人，2023; Zhou等人，2025）。体外研究表明，大豆蛋白纳米纤维（SPNFs）无细胞毒性，也不会加速淀粉样β（Aβ）的聚集，表明其具有很高的生物安全性（Lasse等人，2016; Rahman等人，2023）。因此，SPNFs在铁强化、生物支架和可持续包装方面具有很大的应用前景（Wei等人，2023; Xiang, Wu, Wei, Shao, & Sun，2021; Yuan等人，2025）。然而，大豆蛋白复杂的亚基组成、高分子量和紧凑的结构给阐明其纤维化机制和识别纤维形成区域带来了挑战。Josefsson等人（2019）使用超滤离心法分离出纤维组分，并鉴定出五种作为SPNFs构建块的肽。此外，考虑到纤维核心和非核心区域之间的结构差异会导致不同的稳定性行为，控制纤维降解是一种有效的方法来分离纤维核心区域（Housmans等人，2022）。Zhang和Dee（2023）通过长时间孵育期间成熟纤维的降解进一步确定了豌豆和大豆蛋白纤维的核心区域。这些发现表明，在纤维化降解阶段破坏纤维和非纤维成分之间的平衡有助于去除非核心区域并帮助识别核心。然而，关于大豆蛋白纤维化降解过程及其潜在机制的系统研究不足，限制了基于控制纤维降解进一步识别纤维形成/非纤维区域和核心/非核心区域的能力。这一限制不仅会妨碍成熟纤维的精确调控和应用，还会阻碍对自组装分子机制的理解。

本研究系统地研究了72小时孵育过程中SPNF的形成和降解全过程。通过SDS-PAGE、Th T荧光、AFM和FTIR分析，表征了纤维化的动力学、形态演变和构象转变。基于识别的降解阶段，使用陷阱离子迁移谱飞行时间质谱（TIMS–TOF–MS）进一步表征了纤维核心和非核心区域。最后，进行了分子动力学模拟以阐明大豆蛋白纤维化的分子自组装机制。这项工作全面揭示了大豆蛋白的纤维化行为，有助于更深入地理解其背后的机制。

材料

大豆蛋白分离物（SPI，蛋白质含量91%）通过碱提取和酸沉淀法从Dongsheng-10大豆中提取。Thioflavin T（Th T）和8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid（ANS）购自Macklin Biochemical Co., Ltd。超速离心管（15 mL，100 kDa）、Pepsin（目录号10108057001）和trypsin（目录号T6567）购自Millipore Sigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）。Pierce C18 Tip（20 μL）购自Thermo Fisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

纤维形成区域的释放和组装

根据自组装的最小结构单元的不同，蛋白质纤维化机制可以分为单体模型和多肽模型（Meng等人，2022年）。对于分子结构紧凑的植物蛋白，水解对于释放埋藏的纤维形成区域至关重要，从而促进进一步的纤维化。在本研究中，大豆蛋白在pH 2.0条件下于85°C加热72小时，以阐明整个纤维化过程。

结论

本研究系统地研究了大豆蛋白纤维的形成和降解过程，并利用质谱技术识别了纤维形成区域。在纤维形成阶段（0–24小时），蛋白质亚基迅速水解成小肽，这些小肽随后自组装成纤维结构，表现出约0.15小时的滞后阶段和0.36 FU/h的生长速率。

作者贡献声明

齐宝坤：撰写——审稿与编辑、方法学、研究、概念化。赵赫凯：撰写——初稿、软件、方法学、数据管理、概念化。黄玉阳：研究、数据管理。李阳：监督、资源、项目管理

未引用参考文献

Cao等人，2021；Xu等人，2023。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢重庆市自然科学基金（CSTB2023NSCQ-MSX0601）提供的财政支持。