零下温度下由Chymopapain催化的鱼明胶糖基化反应：结构-功能关系及冷冻保护机制

《Food Hydrocolloids》：Subzero Chymopapain-Catalyzed Glycosylation of Fish Gelatin: Structure-Function Relationships and Cryoprotective Mechanisms

鱼胶冻融稳定性不足，本研究通过低温乙醇-水系统利用木瓜蛋白酶催化鱼胶与壳聚糖的酶促糖基化，实现选择性N-糖基化，显著提升其抗氧化活性（DPPH 92.9%，羟基自由基99.6%）和冻融稳定性（冻融循环6次后浑浊度降低至8.85%）。结构分析显示β-折叠比例增加（38.5%→42.4%），表面疏水性提升（185.5→337.9），并形成稳定水化层。

　　

王鹏凯|周一斌

安徽农业大学食品与营养学院

摘要

由于脯氨酸和羟脯氨酸含量较低，鱼明胶的冻融稳定性较差。本研究开发了一种新型的酶促糖基化策略，利用木瓜蛋白酶在-10°C的乙醇-水体系中催化鱼明胶与壳聚糖的结合。低温条件有利于转糖基化反应而非水解反应，从而在32个特定位点实现了选择性N-糖基化。所得到的结合物表现出显著的结构变化：α-螺旋含量降低（从15.1%降至11.6%），β-折叠片含量增加（从38.5%升至42.4%），表面疏水性增强（从185.5升至337.9），并且抗氧化活性显著提高（DPPH自由基清除率：92.9%；羟基自由基清除率：99.6%），优于未改性的明胶（分别为62.6%和83.8%）。经过六次冻融循环后，冻融稳定性显著提高，析水率降至8.85%，而对照组为44.17%。FTIR分析证实了氢键的保留，LF-NMR显示结合水含量增加（7.1%对比3.0%），并且水分重新分布为固定形式。这种酶法为生产具有优异冻融稳定性和抗氧化性能的多功能生物聚合物提供了一种高效且环保的方法，适用于冷冻食品领域。

引言

由于宗教可接受性和低过敏性，鱼明胶已成为哺乳动物明胶的可持续替代品（Sow & Yang, 2022）。然而，鱼明胶中的脯氨酸和羟脯氨酸含量仅为哺乳动物明胶的50-70%，导致其凝胶强度较弱且热稳定性较差（Huang et al., 2021）。在冻融循环过程中，冰晶的形成会破坏氢键网络，使鱼明胶通过不可逆的析水作用失去超过30%的结合水（Nikoo et al., 2023）。这种结构退化严重限制了其在冷冻食品中的应用。

蛋白质糖基化是一种有效的增强鱼明胶抗冻性能的方法。最新研究表明，引入亲水性多糖链可以通过形成水合层来抑制冰晶生长，从而使抗冻活性提高2.8倍（Wang et al., 2023）。然而，传统的美拉德反应需要苛刻的条件（60-90°C，持续12-48小时），这不仅会导致鱼明胶的热变性，还会产生丙烯酰胺和5-羟甲基糠醛等潜在有害化合物（Liu et al., 2022）。虽然酶促催化可以在较温和的条件下进行，但常规反应温度（25-45°C）仍有可能导致热敏感的鱼明胶基质部分变性（Chen et al., 2023）。因此，开发温和且高效的糖基化方法仍然至关重要。

木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.30）是一种半胱氨酸蛋白酶，在低温和低水活度条件下具有显著的转糖基化活性。该酶的催化三联体（Cys25-His159-Asn175）具有多种优势：宽pH稳定性（pH 3-9）、高有机溶剂耐受性以及相对较低的底物特异性，能够接受多种亲核试剂（Khan et al., 2013）。其催化机制涉及Cys25对底物羰基碳的亲核攻击，形成酰基-酶中间体。在水活度低于0.3的条件下，该中间体优先与糖胺反应，从而实现转糖基化（López et al., 2021）。相比之下，转谷氨酰胺酶仅通过异肽键形成来催化蛋白质交联（Zhang et al., 2022），而胰蛋白酶在零下温度下的活性显著降低（Yang et al., 2023）。值得注意的是，木瓜蛋白酶在-10°C时仍能保持相当的催化活性（Morcelle et al., 2021）。

先前的研究展示了酶促糖基化的潜力和局限性。Hattori等人（2000）使用碱性蛋白酶在37°C下实现了蛋白质-糖的结合，但效率较低（<15%），产物异质性较高。最近，Morcelle等人（2023）在25°C的有机溶剂中提高了木瓜蛋白酶的合成活性，证明了蛋白酶催化合成的可行性。然而，这些研究忽略了反应温度与底物稳定性之间的关键平衡，特别是对于像鱼明胶这样的热不稳定蛋白质。根本挑战在于如何在低温下实现高效的糖基化同时保持鱼明胶的天然结构。

为了解决这一挑战，本研究采用了一种新型的低温、非水相催化策略，使用木瓜蛋白酶。壳聚糖含有丰富的游离氨基，并具有已证实的抗冻性能（Xu et al., 2022），作为糖基化修饰剂。通过利用木瓜蛋白酶在乙醇/水双相体系中的独特低温催化性能，我们旨在提高鱼明胶的冻融稳定性。通过全面的光谱表征、结构分析和功能评估，本研究阐明了低温酶促糖基化的分子机制，并揭示了糖基化鱼明胶优异抗冻性能的结构基础。这些发现为开发用于食品应用的新型冻稳定性生物材料提供了理论指导。

材料

商业明胶（来自鱼皮的A型，纯度≥99%，分子量≥20 kDa）、壳聚糖（分子量≥200 kDa，脱乙酰度80-95%，纯度≥99%）、乙醇和三氯乙酸均购自中国北京的中药集团化学试剂有限公司。木瓜蛋白酶（来自木瓜乳胶，分子量26 kDa，活力1198 kat/g）购自中国广东的深圳试剂公司。其他所有化学品均为分析级或同等纯度。

糖基化明胶的制备

四种

UV-Vis分析

通过分光光度法监测明胶与壳聚糖之间的糖基化反应进程，因为中间体和最终棕色产物的形成可以通过294 nm和420 nm处的吸光度来追踪（Ajandouz et al., 2001; Liu et al., 2022）。如图1(a, b)所示，明胶-壳聚糖结合物在294 nm处的吸光度明显高于对照组。这归因于无色中间体的形成

结论

本研究成功开发了一种低温酶促糖基化方法，通过木瓜蛋白酶催化的明胶与壳聚糖结合，改善了鱼明胶的抗氧化性能和冻融稳定性。关键创新在于利用木瓜蛋白酶在-10°C下的转糖基化活性，实现了选择性N-糖基化，同时避免了热变性。糖基化引发了深刻的结构变化，包括

CRediT作者贡献声明

王鹏凯：方法学设计、资金获取、数据分析。周一斌：资源调配、项目管理、方法学实施

未引用的参考文献

Chen et al., 2023; Chen et al., 2023; Chen et al., 2023; Li et al., 2022; Liu et al., 2022; Soglia et al., 2021; Wang et al., 2023; Wang et al., 2023; Wang et al., 2023; Wang et al., 2023; Wang et al., 2022; Yang et al., 2023; Yang et al., 2022; Zhang et al., 2022; Zhang et al., 2022; Zhang et al., 2023; Zhang et al., 2023; Zhang et al., 2022; Zhang et al., 2021; Zhang et al., 2023.

利益冲突声明

本手稿中不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32302139）的支持。