《International Journal of Biological Macromolecules》：Dual-TERM enables simultaneous profiling of 5′ and 3′ terminal modifications in small RNAs by integrating enzymatic treatment with PBA-PAGE
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提出一种结合酶处理和PBA-PAGE的Dual-TERM方法，有效区分小RNA的5'磷酸化和3'末端四种主要修饰（3'-OH、3'-Nm、3'-P、3'-cP），验证其适用于内源miRNA、piRNA及5' tRNA片段分析，并展望高通量测序联用潜力。
杨慧如|张斌|朱思静|张帅彪|于晓菲|张磊|任国东|陈苏苏
中国上海复旦大学生命科学学院张江mRNA创新与转化中心遗传与复杂表型发育国家重点实验室，邮编200438
摘要
小RNA具有多种末端修饰，这些修饰反映了它们的生物发生过程，并影响其稳定性和功能。然而，使用现有方法同时区分这些修饰仍然具有挑战性。在这里，我们介绍了一种基于凝胶的双末端修饰分析方法（Dual-TERM），该方法结合了酶预处理和苯硼酸聚丙烯酰胺凝胶电泳（PBA-PAGE），以解析小RNA的5′和3′末端修饰。利用合成RNA，我们证明Dual-TERM能够可靠地区分四种主要的3′末端核糖修饰（3′-OH、3′-Nm、3′-P和3′-cP），并基于微小的迁移率变化检测5′磷酸化状态。我们使用来自哺乳动物和植物的内源性小RNA（包括miRNA、piRNA和5′ tRNA片段）验证了该方法，确认了物种特异性的修饰模式。由于其简单性和敏感性，Dual-TERM为表征小RNA的末端修饰提供了一个多功能工具，并且在与下一代测序结合使用时具有高通量分析的潜力。
引言
不同类型的小RNA通常具有不同的末端修饰，这些修饰是其生物发生的关键特征，并影响其功能和/或稳定性[1]、[2]。经Dicer处理的microRNA（miRNA）和small interfering RNA（siRNA），以及与Dicer无关的PIWI相互作用RNA（piRNA），都具有5′单磷酸基团（5′-P），这是Argonaute（AGO）装载所必需的[3]。值得注意的是，由秀丽隐杆线虫中的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）复合体产生的次级siRNA（22G-RNAs）具有5′三磷酸基团（5′-PPP）[4]。动物miRNA和许多siRNA在其3′末端保留未修饰的2′-3′顺式二醇（3′-OH）[5]。相比之下，植物miRNA和所有类型的siRNA、动物piRNA以及与Drosophila AGO2结合的siRNA在3′末端获得2′-O-甲基化（3′-Nm）修饰，这赋予了它们抵抗3′尿苷酸化和3′-5′外切核酸酶切割的能力[6]、[7]。此外，5′ tRNA片段和5′ tRNA片段主要以5′-P结尾，同时可能带有3′磷酸基团（3′-P）或2′,3′环状磷酸基团（3′-cP）[8]、[9]。另外，性激素依赖的tRNA衍生物RNA（3′-SHOT-RNAs）的特征是5′羟基（5′-OH）——这是由内切核酸酶切割产生的——以及来自氨基酰化成熟tRNA的3′氨基酸部分[8]。表征小RNA的修饰状态对于识别其催化酶和深入理解其生物学功能至关重要。
尽管液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）被认为是核酸修饰表征的金标准，但其应用于靶向内源性RNA修饰时受到纯化挑战的限制[10]。另一种方法包括酶处理后进行电泳迁移率分析或基于选择性连接的下一代测序[11]。碱性磷酸酶（AP），如虾碱性磷酸酶（SAP）和小牛肠磷酸酶（CIP），可以有效将5′-P和3′-P末端转化为羟基，但对3′-cP修饰无效。相比之下，T4多核苷酸激酶（T4 PNK）可以去除3′-P和3′-cP末端的磷酸基团。它还可以将磷酸基团从ATP转移到5′-羟基末端，或者交换5′-磷酸基团末端的磷酸基团。由于3′-cP可以通过HCl处理转化为3′-P，因此有时使用HCl加AP处理作为额外证据来区分3′-cP与其他修饰[11]。不同酶处理后的RNA在磷酸含量上会发生变化，磷酸化的RNA比未磷酸化的RNA迁移得更快。因此，可以通过比较电泳迁移率差异来推断RNA修饰。这种策略已被用于表征各种小RNA修饰[8]、[9]、[12]、[13]。
然而，当前的方法存在三个主要局限性：1) 在不同条件下处理的RNA在常规PAGE分离时仅显示出轻微的迁移率差异（一个磷酸基团对应约0.5个核苷酸的迁移速度差异），这需要单核苷酸分辨率，对于较长的RNA尤其具有挑战性[11]。2) AP和T4 PNK处理都无法区分3′-OH和3′-Nm[11]。3) 5′修饰，包括5′-OH、5′-P、5′-PPP等，对AP或T4 PNK的反应不同，进一步增加了数据解释的复杂性。苯硼酸（PBA）特异性地与含有顺式二醇的RNA相互作用，在变性PBA-PAGE过程中导致大的条带移动。该技术已被用于区分具有3′末端核糖修饰（即3′-Nm、3′-P、3′-cP）的小RNA和具有自由末端核糖（即3′-OH）的小RNA[15]、[16]、[17]。理论上，将AP/T4 PNK预处理与PBA-PAGE结合应该能够同时有效地区分主要的5′和3′修饰，轻微的迁移率变化反映磷酸基团的数量，大的条带移动表明存在顺式二醇。我们将这种方法称为Dual-TERM。
材料与条件
拟南芥（Arabidopsis）野生型（Col-0）植物在22°C、长日照条件下（16小时光照，光照强度约为120 μmol m-2 s-1 / 8小时黑暗）的土壤中生长。HEK293T细胞（CRL-3216）购自美国典型培养物保藏中心。A549细胞（TCHu150）由中国科学院细胞库提供。细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，WISENT）中培养，补充10%胎牛血清（FBS，WISENT）和100 IU/mL青霉素-链霉素
使用合成RNA标准物进行末端修饰检测的基准测试
为了验证Dual-TERM的可行性，我们合成了具有5′-OH和不同3′末端的sRNA寡核苷酸（即3′-OH、3′-Nm或3′-P）（表S1）。我们使用Methanobacterium thermoautotrophicum RNA连接酶（MthRnl）[19]将3′-P结尾的sRNA转化为3′-cP结尾的sRNA。这些合成sRNA经过重组SAP（rSAP）或T4 PNK处理，并在含有或不含0.2% PBA的变性PAGE中分离（图S1 A）。我们首先比较了条带移动模式。3′-OH结尾的sRNA没有
讨论
总之，我们的研究建立了一种改进的方法，可以稳健地区分小RNA中的四种主要类型的3′末端核糖修饰和5′磷酸化状态。尽管本研究中同时使用了传统的PAGE和PBA-PAGE，但一旦建立了PBA-PAGE，单独使用PBA-PAGE就足以进行Dual-TERM分析（图形摘要）。理论上，我们的方法可以通过在PBA-PAGE分离后回收小RNA，然后与基于连接的深度测序结合使用，从而实现
CRediT作者贡献声明
杨慧如：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，研究，正式分析，数据管理。张斌：验证，研究。朱思静：资源提供。张帅彪：资源提供。于晓菲：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。张磊：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。任国东：撰写 – 审稿与编辑，资金获取，概念构思。陈苏苏：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了上海基础研究试点计划-复旦大学（21TQ1400100）、上海市科学技术委员会（22XD1420200）、国家自然科学基金（82304664、32470591）以及中央政府层面的关键项目（2060302）的支持。我们还要感谢Jin Zheyu在A549细胞培养方面提供的技术支持。
