《ACS Applied Nano Materials》：Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Activatable Gold Nanoparticles for In Situ Zymography and Diagnostics of Neurofibromatosis Type 2 (NF2) Tumors
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本文开发了一种基质金属蛋白酶-9（MMP-9）激活的金纳米颗粒（AuNPs），通过蛋白酶可切割肽实现对前庭神经鞘瘤（VS）组织中蛋白酶活性的灵敏检测。该纳米平台在肿瘤组织中区分肿瘤与健康神经的准确率超过95%，可检测2毫米肿瘤，较传统磁共振成像（MRI）提前约23个月发现病变，并能纵向监测治疗响应过程中MMP-9活性变化，为神经纤维瘤病2型（NF2）相关神经鞘瘤病的早期诊断和疗效评估提供了新型分子工具。
引言
2型神经纤维瘤病相关神经鞘瘤病（NF2-SWN）是一种以神经系统多发性肿瘤为特征的遗传性肿瘤易感综合征。其标志性病变双侧前庭神经鞘瘤（VS）可导致听力丧失、眩晕及危及生命的脑干压迫。当前影像学方法常在肿瘤发展晚期才能检测到NF2相关VS，可能导致治疗干预延迟。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一种在NF2相关VS的细胞外基质（ECM）重塑和肿瘤进展中起关键作用的蛋白酶，使其成为基于活性传感的理想分子靶点。
结果与讨论
MMP-9可切割肽的鉴定
研究旨在开发一种纳米颗粒传感器，用于时空分析VS进展过程中的MMP-9活性。首先，研究人员致力于鉴定一种能被MMP-9高效且特异性切割的肽底物。通过筛选包含26种肽的自定义库，发现肽S8（序列GPLAYWAR）对MMP-9表现出强切割效率，同时对MMP-2、MMP-10和PRSS3等其他蛋白酶活性较低，显示出良好的特异性。
MMP-9传感纳米颗粒的性能优化
在鉴定出MMP-9可切割的FRET肽后，研究假设通过在多价金纳米颗粒（AuNP）表面呈现S8肽可以进一步优化其对抗MMP-9的敏感性和特异性。金被选作纳米颗粒核心材料，因其具有良好的生物相容性、惰性以及明确的表面化学性质，能够实现稳定且可重复的肽偶联。通过系统优化聚乙二醇（PEG）连接子长度和肽价态，确定使用5 kDa PEG连接子和1:12的AuNP:肽价态时，能实现最大的靶向荧光激活。透射电子显微镜（TEM）证实AuNPs是单分散的。成功的肽偶联通过琼脂糖凝胶电泳和紫外-可见光谱法得以验证，动态光散射（DLS）显示表观流体动力学尺寸从20纳米增加到42纳米。该检测方法在0-100 pg/mL范围内呈现线性响应，对MMP-9的检测限（LOD）低至10 pg/mL（0.109 pM），灵敏度比商业ELISA高出近50%，且将检测时间从3小时缩短至15分钟以内。酶动力学分析显示S8肽的米氏常数（Km）为16.92 × 10–9M，催化效率（Kcat/Km）为1.93 × 107M–1s–1。
细胞摄取与内体标记物共定位
接下来研究了纳米颗粒在分泌MMP-9的NF2小鼠神经鞘瘤细胞系（MD-MSC）中的摄取情况。浓度高达500 nM的S8-AuNPs和S23-AuNPs（对照）均显示出最小的细胞毒性，细胞存活率超过95%。共聚焦显微镜定量显示，S8-AuNPs的内化在1至4小时内呈线性增加，之后趋于平稳。S8-AuNPs表现出高效的MMP-9切割，导致淬灭剂释放和荧光显著增加，而S23-AuNPs仅显示微弱荧光。使用广谱蛋白酶抑制剂马立马司他（Marimastat）处理细胞后，荧光强度降低了15倍。通过Mander系数分析考察细胞内共定位情况，发现S8-AuNPs与早期内体标记物Rab4的系数为0.81，与晚期内体标记物Rab11的系数为0.67，表明存在良好的重叠。这些发现表明S8-AuNPs具有良好的生物相容性和高效的内吞作用，凸显了其在MMP-9富集环境中进行蛋白酶激活传感的潜力。
原位酶谱分析与肿瘤蛋白酶成像
为了研究S8-AuNPs区分肿瘤与非肿瘤组织的能力，研究人员开发了一种改良的原位酶谱分析方法。该方法通过合成一种包含带正电的聚精氨酸（poly-R）区域和带负电的聚谷氨酸（poly-E）区域、通过MMP-9可切割肽连接子（S8Z）连接的肽序列，并将其偶联到PEG-AuNPs上。当S8Z被MMP-9切割后，释放出的带正电结构域通过静电相互作用与带负电的组织结合。用S8Z-AuNP处理的肿瘤显示出比对照dS8Z-AuNP（使用非MMP-9切割的D-氨基酸序列）近4倍的荧光增强，表明MMP-9保持了酶活性。纳米颗粒能够在VS组织中精确定位MMP-9活性，且背景信号低。正常坐骨神经中未观察到荧光信号，加入小分子MMP-9抑制剂（MMP-9-IN-I）可显著降低S8Z-AuNP的结合。在所检查的6个肿瘤中，S8Z-AuNP对MMP-9的检测显示出极强的诊断能力（受试者工作特征曲线下面积AUC = 1.0）。研究还发现，在人类VS组织切片中，S8Z-AuNP的荧光强度与肿瘤体积呈线性相关。经MMP-9-IN-I处理的肿瘤荧光显著降低，证实信号主要源于MMP-9活性。S8Z-AuNP的高信噪比使其能够区分体积差仅为0.07 cm3的肿瘤。
体内神经鞘瘤中MMP-9活性的可视化
由于磁共振成像（MRI）在检测肿瘤进展过程中的生物学变化方面灵敏度不足，研究人员开发了MMP-9可切割的纳米颗粒，以实现体内肿瘤MMP-9活性的实时检测。将Cy5标记的S8或对照S23通过5 kDa PEG连接子偶联到AuNPs上，使得MMP-9介导的切割能够恢复Cy5标记肽在肿瘤组织内的荧光。在NF2神经鞘瘤同种移植模型中进行瘤内注射后，S8Q-AuNPs在45分钟内的荧光强度比S23Q-AuNPs高13.6倍。ROC分析显示了稳健的分类能力（AUC = 0.937）。免疫荧光（IF）证实S8Q-AuNPs的荧光高于S23Q-AuNPs。S8Q-AuNPs优先在肿瘤中积累，其次在肝脏和脾脏中有摄取。S8Q-AuNPs与肿瘤中的MMP-9和帽结合蛋白eIF4E密切共定位（Mander系数：MMP-9为0.99，eIF4E为0.98）。这些结果表明S8Q-AuNPs能够定量体内的肿瘤相关MMP-9活性。
纳米颗粒传感MMP-9活性预测神经鞘瘤生长
为了将肽-AuNPs作为诊断剂进行评估，在荷神经鞘瘤同种移植瘤的小鼠模型中通过静脉注射系统给药后评估体内荧光动力学。注射S8Q-AuNPs的小鼠其肿瘤荧光显著高于注射S23Q-AuNPs的小鼠。在肿瘤进展过程中不同日期对小鼠连续注射纳米颗粒，以评估AuNP信号与肿瘤体积之间的相关性。在第14天至第17天之间，在肿瘤体积出现明显变化之前，观察到荧光显著增加。这种MMP-9活性的早期增加表明，纳米颗粒可以在明显的肿瘤生长之前检测到蛋白酶活性的变化。通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对元素金进行的离体分析证实，纳米颗粒的积累与荧光相关。据估计，与常规MRI相比，肽-AuNPs可能使肿瘤检测提前约23个月，从而可能在患者听力尚佳时实现更早的干预。
坐骨神经神经鞘瘤模型中MMP-9与侵袭、增殖和血管生成的关联
在验证了全身给药的AuNPs能够定量皮下神经鞘瘤小鼠模型中的MMP-9活性后，接下来评估了相同的AuNPs是否能够检测坐骨神经神经鞘瘤小鼠模型中的MMP-9活性。对荷坐骨神经神经鞘瘤同种移植瘤的小鼠静脉注射后，体内荧光成像显示，用S8Q-AuNPs处理的肿瘤其Cy5荧光显著高于用S23Q-AuNPs处理的肿瘤。银染色显示纳米颗粒在肿瘤边界处积累增强，S8Q-AuNP荧光信号在侵袭前沿增强，这与MMP-9活性相关。肿瘤相关巨噬细胞（CD68+）和活化成纤维细胞（α-SMA+）与S8-AuNPs共定位，而与S23-AuNPs不共定位。S8Q-AuNP的Cy5信号还与细胞增殖标记物（Ki-67，共定位79.5%）、血管生成标记物（CD31，共定位93.1%）和凋亡标记物（裂解的胱天蛋白酶3，共定位59.6%）共定位。这些数据表明，MMP-9活性能够以高空间精度可视化，识别出与肿瘤侵袭、生长、血管生成和凋亡相关的特定区域，展示了早期肿瘤检测的潜力。
药物治疗期间MMP-9活性的动态监测
由于对VS相关MMP-9的无创实时监测仍然有限，研究人员评估了S8-AuNPs在治疗过程中追踪MMP-9活性并将其抑制与肿瘤生长抑制相关联的有效性。对荷皮下神经鞘瘤同种移植瘤的小鼠注射MMP-9-IN-1（20 mg/kg），而对照组小鼠接受DMSO。MMP9-IN-I治疗组的肿瘤生长显著受到抑制。荧光纳米颗粒成像显示MMP-9活性显著降低。蛋白质印迹分析证实，MMP-9-IN-1处理的肿瘤中MMP-9表达降低了70%，同时凋亡增加。这些发现表明，S8Q-AuNPs能够在蛋白酶抑制剂治疗期间对VS中的MMP-9活性进行实时成像，并作为治疗响应的基于活性的生物标志物。
结论
本研究证明，蛋白酶响应的金纳米颗粒能够测量与VS相关的MMP-9活性，以显著的灵敏度有效区分肿瘤和非肿瘤区域。该研究进一步加深了我们对MMP-9在VS进展中作用的理解。它通过空间分辨的活性检测，突出了MMP-9作为生物标志物和治疗靶点的核心作用，为早期诊断和增强治疗监测提供了机会。将多重肽筛选与基于切割的原位酶谱分析相结合，为靶向NF2相关肿瘤（超越VS）中的蛋白酶失调提供了一个强大的框架。
