基于响应面-深度神经网络协同优化杏仁多酚超声酶法提取及其体外生物活性研究

《ACS Omega》：Optimization of Enzyme–Ultrasound-Assisted Extraction of Almond (Amygdalus communis L.) Phenolics using Response Surface Methodology and Deep Neural Networks, and Their In-Vitro Bioactivities

本研究采用响应面法(RSM)与深度神经网络(DNN)协同优化酶-超声辅助提取杏仁(Amygdalus communis L.)多酚与黄酮工艺，系统评价了乙醇浓度、超声时间、液料比及酶用量对总多酚(TPC)和总黄酮(TFC)得率的影响。结果表明RSM模型(R2=0.9509)预测精度优于DNN(R2=0.6844)，最优工艺下提取物中鸟苷、原儿茶酸、咖啡酸、纳欣素、花旗松素含量分别达287.78±1.93、49.01±0.82、17.35±0.88、231.41±3.85、5.90±0.18 μg/g。该提取物展现出显著抗氧化活性(DPPH清除率87.21%、ABTS清除率74.57%、·OH清除率66.42%、O2·–清除率69.03%)，并对α-淀粉酶(抑制率80.86%)、α-葡萄糖苷酶(抑制率82.27%)及胰脂肪酶(抑制率72.73%)具有显著抑制效果，表明其具降血糖血脂潜力。细胞实验显示250 μg/mL以下浓度对RAW264.7细胞无毒性，为杏仁功能成分开发利用提供理论依据。

　　

材料与方法

研究以新疆产杏仁为原料，经石油醚脱脂后采用复合酶(果胶酶:纤维素酶=1:2)结合超声辅助提取活性成分。通过单因素实验考察乙醇浓度(20%-100%)、超声时间(10-50 min)、液料比(1:10-1:50 g/mL)及酶添加量(0-4 mg/g)对总多酚含量(TPC)和总黄酮含量(TFC)的影响，并采用熵权法计算综合评价值(CE)。基于Box-Behnken设计构建响应面模型，同时建立深度神经网络模型进行对比优化。

提取工艺优化

单因素实验表明，乙醇浓度60%时TPC与TFC得率最高，浓度过高会导致细胞脱水及蛋白变性；超声时间30 min时提取效果最佳，延长超声可能引起热敏成分降解；液料比1:30 g/mL时兼顾提取效率与溶剂消耗；酶添加量2 mg/g可有效破坏细胞壁结构。响应面方差分析显示模型极显著(p<0.0001)，二次项A²、B²、C²、D²均为极显著水平，交互项BD与CD显著。DNN模型经500次迭代后测试集R²=0.6844，预测误差0.73%。最终确定最优工艺为乙醇浓度65%、超声时间31 min、液料比29 g/mL、酶添加量2 mg/g，此条件下CE预测值5.396 mg/g，验证实验值为5.362±0.048 mg/g，相对误差0.63%。

活性成分分析

HPLC分析鉴定出5种主要成分：鸟苷(287.78±1.93 μg/g)、原儿茶酸(49.01±0.82 μg/g)、咖啡酸(17.35±0.88 μg/g)、纳欣素(231.41±3.85 μg/g)和花旗松素(5.90±0.18 μg/g)。方法学验证显示各化合物在3.125-50 μg/mL范围内线性良好(R²>0.999)，精密度、重复性、稳定性RSD均<5%，加样回收率96.58%-102.40%。

生物活性评价

抗氧化实验表明，提取物对DPPH、ABTS⁺、·OH和O₂^·–的IC₅₀值分别为3.22±1.05、3.47±1.53、3.83±2.20和18.90±1.13 mg/mL，在6 mg/mL时清除率分别达87.21%、74.57%、66.42%和69.03%。降糖活性方面，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为4.04±1.56 mg/mL和9.70±2.08 mg/mL，30 mg/mL时抑制率超80%。降脂实验中胰脂肪酶抑制IC₅₀为39.17±0.83 mg/mL，60 mg/mL时抑制率达72.73%。CCK-8法显示提取物在31.25-250 μg/mL浓度内对RAW264.7细胞无显著毒性(存活率>80%)。

结论

本研究成功建立超声-酶法协同提取工艺，RSM模型在预测精度与经济效益方面均优于DNN模型。杏仁提取物富含多酚黄酮类成分，具有显著抗氧化、降血糖血脂活性及良好生物安全性，为开发杏仁功能性食品提供技术支撑。