《ACS Physical Chemistry Au》：Determination of Nucleotide–Nucleotide and Nucleotide–Amino Acid Binding Interactions from All-Atom Potential-of-Mean-Force Calculations
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本综述通过全原子分子动力学模拟与平均力势（PMF）计算，系统描绘了RNA核苷酸间及核苷酸-氨基酸间的相互作用图谱，为理解生物分子凝聚体（如应力颗粒、核仁）的自组装机制提供了原子尺度见解。研究揭示了氢键、π-π堆积、阳离子-π及静电相互作用在调控凝聚体理化性质中的关键作用，并为粗粒化（CG）模型（如CALVADOS2、HPS-Urry）的参数化提供了定量数据库，对神经退行性疾病（如ALS/FTD）相关异常聚集机制的解析具有重要启示。
生物分子凝聚体：无膜细胞器的自组装基石
细胞内区室化是细胞在时空上组织组分以执行多样生物学功能的基础过程。这一生物分子组织依赖于膜结合细胞器和无膜细胞器（亦称生物分子凝聚体）的协同动力学。凝聚体被认为通过蛋白质和核酸溶液的自发自组装形成，这一机制因其对健康和疾病的广泛影响而受到跨学科领域的广泛关注。凝聚体形成使细胞能够建立高浓度且瞬时的生物分子组装体，如卡哈尔体、应力颗粒、P小体和核仁，这些结构 facilitated 生物分子区室化、基因表达调控、细胞应激反应和信号转导等关键过程。鉴于许多凝聚体主要由蛋白质和核酸（RNA或DNA形式）组成，理解其相互作用在通过相分离驱动自组装和组织中的核心作用至关重要。值得注意的是，从动态的功能性凝聚体向不可逆的类固体聚集体的转变，是由局部增强的蛋白质间和RNA-RNA相互作用所介导的，其中一些转变与多种神经退行性疾病的发生相关，导致异常的凝聚体形成、原纤维聚集和最终的细胞毒性。
在生物分子凝聚体复杂的分子相互作用网络中，静电相互作用在调节多种生物分子的凝聚中扮演核心角色。在此背景下，RNA被确定为一种主要的静电驱动凝聚体调节剂，能够与富含正电荷和极性氨基酸的蛋白质RNA识别基序结合。更重要的是，最近的体外实验也表明RNA自身能够发生相分离，这得益于低浓度镁离子对磷酸基团间静电排斥的屏蔽作用。此外，三级相互作用，如G-四链体（G-quadruplex, G4）结构（由两个或多个通过Hoogsteen氢键以平面方形排列连接的鸟嘌呤四联体组成的非经典DNA/RNA构型），与导致动力学捕获状态的RNA异常聚集相关。尽管已知π-π堆积、氢键和阳离子-π相互作用调节RNA及RNA-蛋白质关联，进而影响凝聚体的关键物理化学性质（如粘度和表面张力），但形成RNA凝聚体的精确相互作用以及盐浓度的作用尚未被完全探索。
在过去十年中，分子动力学（MD）模拟已成为研究凝聚体形成的基本工具，为其相行为、时间依赖性材料特性及调控这些过程的关键残基提供了机制性见解。特别是残基分辨率的粗粒化（CG）模型，如CALVADOS2、HPS-Urry或Mpipi-Recharged，显著提高了我们以精确且计算高效的方式确定生物分子凝聚体物理化学性质的能力。早期模型主要侧重于重现实验回转半径并定性捕捉不同蛋白质的相行为，而新模型的设计焦点已转向利用原子尺度模拟、生物信息学或基于机器学习的参数化等自下而上的方法。其中，平均力势（PMF）计算在评估各种生物系统（包括肽、氨基酸和RNA-蛋白质相互作用）的结合自由能方面日益突出，为理解凝聚体形成或异常液-固转变的机制和相互作用提供了亚分子水平的见解。
核苷酸-核苷酸相互作用的不同结合模式表征
本研究通过显性溶剂和离子的全原子PMF计算，系统表征了RNA核苷酸对及核苷酸-氨基酸相互作用。研究首先通过经典碱基配对分析评估了代表性原子力场（AMBER03ws和CHARMM36）的性能，观察到两种力场在预测上具有显著一致性。对核苷酸-核苷酸不同相互作用模式的进一步合理化涉及核糖-核糖、磷酸-磷酸以及RNA三级相互作用（如G-四链体形成）的PMF计算。研究发现，盐浓度对这些相互作用有影响，增加离子强度会降低磷酸-磷酸结合的静电自排斥。
具体而言，对经典Watson-Crick碱基对（CG、AU）和非经典GU摆动对的计算重现了预期的氢键层级（CG > AU > GU）。CG对显示出最深的自由能最小值，其次是AU对，两者之比合理接近由氢键数量推导的2/3预期值。两种力场产生相似的轮廓，尽管AMBER03ws的PMF始终显示出稍深的最小值，这归因于其捕获更强相互作用的能力。重要的是，两种模型再现了相同的相对能量顺序（CG > AU > GU），证明了方法的稳健性。扩展的自由能计算涵盖了所有剩余的核苷酸组合，显示CC是最具能量优势的非经典对，而UU和AC对表现出相似的稳定性，其余对的相互作用能量与系统固有的热波动（~0.5 kcal/mol）同量级。
除了碱基-碱基相互作用，研究还评估了核糖-核糖和磷酸-磷酸相互作用。核糖-核糖相互作用曲线显示cis和trans构型均具有弱吸引能，且对不同核苷酸对不敏感，表明核糖形成瞬时相互作用而非驱动核苷酸关联或RNA相分离。磷酸-磷酸的PMF曲线主要反映排斥相互作用，cis构型显示出比trans构型略大的负能量值，其结合能本身并不能完全决定相互作用模式，因为PMF的形状也会影响残基的相互接近方式。此外，对G-四链体结构的PMF计算显示出链间的强相互作用，自由能最小值为-25 kcal/mol，其全局稳定性源于多个氢键的协同积累。
盐浓度对核苷酸相互作用具有调制作用。增加盐浓度对碱基-碱基相互作用的结合强度影响适中，仅观察到从0 M到3 M盐浓度时结合强度显著降低。相反，增加盐浓度预期主要调制静电相互作用，这在核苷酸中主要与带负电的磷酸基团相关。对AU和CG对的磷酸-磷酸相互作用分析表明，静电排斥随着盐浓度升高而逐渐被屏蔽。对于核糖-核糖相互作用，在高盐浓度下短程相互作用变得更具吸引力，有效阱深约增加0.5 kcal/mol，几乎翻倍。
氨基酸 pairwise 相互作用的力场基准测试
蛋白质是驱动生物分子凝聚体形成的主要构建块，因此氨基酸-核苷酸相互作用的计算对于理解亚分子水平的相分离至关重要。在分析氨基酸-核苷酸相互作用之前，研究首先评估了AMBER03ws/TIP4P2005力场对氨基酸相互作用的描述，并与广泛用于评估氨基酸和肽相互作用的a99SB-disp/TIP4P-disp模型进行了对比。
计算了五种在相分离蛋白中富集的氨基酸对（Ala-Ala、Arg-Arg、Arg-Asp、Arg-Tyr和Tyr-Tyr）的PMF曲线。结果显示，两种力场的能量曲线一致，且与预期行为相符。具体而言，Arg-Tyr（阳离子-π）和Tyr-Tyr（π-π）表现出最高的结合亲和力。两种力场之间存在差异：AMBER03ws预测Arg-Asp、Arg-Tyr和Tyr-Tyr对的最小值比a99SB-disp更深，反映了捕获侧链间分子相互作用的不同能力。相反，a99SB-disp更有利于同电荷残基（如Arg-Arg）之间的吸引相互作用，而AMBER03ws对相反电荷对（如Arg-Asp）显示出更强的亲和力。总体而言，两种力场对蛋白质凝聚体形成相关的相互作用结合模式提供了一致的描述。
跨不同结合模式的核苷酸-氨基酸相互作用表征
RNA通过与蛋白质建立异型相互作用来调节凝聚体的稳定性和材料性质，是生物分子凝聚的基本调节剂。因此，研究扩展PMF计算以揭示支撑多价凝聚的核苷酸-氨基酸相互作用。研究采用AMBER03ws力场表征了四种RNA核苷酸（A、C、G、U）与20种天然氨基酸的相互作用。
初步系统分析中，将每个氨基酸的侧链朝向核苷酸的含氮碱基取向。结果显示，核苷酸-氨基酸（碱基与侧链之间）的相互作用通常弱于经典碱基-碱基相互作用，但与生理条件下的氨基酸-氨基酸相互作用相当。有趣的是，有七种氨基酸（Lys、Arg、Asp、Glu、Gln、Ser和Asn）与大多数核苷酸，特别是C和G，表现出显著的相互作用。带正电荷氨基酸（Arg和Lys）对C和G表现出强亲和力，而与A和U的结合显著较弱。Arg与所有核苷酸的相互作用均强于Lys（尿苷除外），这与Arg作为"sticker"的预期作用一致。带负电氨基酸（Asp和Glu）也通过其碱基与某些核苷酸表现出显著结合。芳香族残基（Tyr、Phe、Trp）由于 imposed 的取向阻碍了π-π堆积，显示出可忽略的结合。极性氨基酸（Gln、Ser、Asn）表现出显著结合能（~2-3 kcal/mol）。其余氨基酸（Cys、Met、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile）的相互作用可忽略（E ? 1 kcal/mol），因此对稳定相分离的蛋白质-RNA相互作用贡献很小。从核苷酸角度看，胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）是蛋白质-RNA相互作用中最相关的残基，与几种氨基酸（如Arg、Glu、Gln）的结合亲和力高达~3 kcal/mol。尿苷（U）也能与代表性氨基酸显著相互作用，但结合强度通常低于C和G。相反，腺苷（A）仅显示弱相互作用。
研究进一步关注了与生物分子凝聚特别相关的替代特异性核苷酸-氨基酸相互作用。具体探索了：（i）带电氨基酸（Arg、Lys、Glu、Asp）与核苷酸磷酸基团的相互作用；（ii）芳香族残基（Tyr、Phe）通过π-π堆积与核苷酸碱基的结合；（iii）酪氨酸与胞嘧啶和尿苷核糖部分之间的相互作用。π-π堆积相互作用的计算揭示了强结合能（5-6 kcal/mol），在所有核苷酸-氨基酸对中相似，与CG碱基配对的相互作用能相当，强调了芳香族接触在RNA-蛋白质凝聚体形成和稳定中的公认作用。对磷酸基团静电相互作用的评估显示，与精氨酸（Arg）的相互作用最强，达到约3.5-4.0 kcal/mol。尽管赖氨酸（Lys）侧链带正电，但与精氨酸相比，其对磷酸基团仅显示出中等吸引相互作用。最后，计算了酪氨酸与胞嘧啶和尿苷核糖部分之间的相互作用，考虑了两种不同构象：两种环堆叠（π-π堆积）和酪氨酸侧链垂直于核糖平面取向（T形）。对于两种核苷酸-Tyr对，π-π堆积相互作用显著强于T形相互作用，尽管这些π-π相互作用弱于Tyr芳香环与C和U含氮碱基之间的相互作用。重要的是，虽然T形构象产生的结合与通常认为显著的相互作用（E ? 2 kcal/mol）相比可忽略不计，但Tyr与核糖之间的π-π堆积显示出与氨基酸-氨基酸相互作用（如Tyr-Tyr相互作用）相当的强度，从而显著促进了RNA-蛋白质凝聚体的稳定。
结论：为生物分子凝聚体建模提供相互作用的定量图谱
本研究对与生物分子凝聚体形成相关的核苷酸和氨基酸相互作用进行了广泛分析。通过在全原子MD模拟中应用平均力势计算，研究了许多核苷酸-核苷酸、氨基酸-氨基酸和核苷酸-氨基酸对的多种构型。对不同核苷酸-核苷酸对结合模式的研究再现了基于氢键数量的预期能量层级，并对非经典碱基对、核糖-核糖、磷酸-磷酸相互作用以及G-四链体三级相互作用进行了表征。盐浓度效应分析表明，增加盐浓度会导致碱基间结合适度减弱，核糖样相互作用适度增强，并显著削弱磷酸-磷酸排斥相互作用。
研究进一步通过扩展PMF计算至氨基酸来表征残基-残基相互作用。基准测试显示AMBER03ws与a99SB-disp力场在氨基酸对相互作用上近乎定量一致。随后估算了所有20种氨基酸与四种RNA核苷酸的相互作用，发现仅一部分氨基酸（Lys、Arg、Asp、Glu、Gln、Ser、Asn）与大多数核苷酸建立了显著吸引相互作用，主要由氢键和阳离子-π相互作用驱动。对特定生物学相关相互作用（包括π-π堆积、磷酸-侧链接触和核糖-侧链相互作用）的补充分析，揭示了π-π堆积是相分离中涉及的一种强相关结合模式，与磷酸基团的静电相互作用对精氨酸尤其显著，且核糖-π堆积成为生物分子凝聚体中一种重要的潜在RNA-蛋白质相互作用。总之，研究结果揭示了核苷酸和氨基酸之间的特异性结合模式，为了解残基水平相互作用如何在生物分子凝聚体中更大尺度上影响分子组织提供了见解。这项工作为理解核苷酸-氨基酸结合提供了详细的相互作用库，为改进蛋白质和核酸凝聚体的粗粒化模型未来发展提供了基础，并为在分子水平上合理化体外和体内实验证据提供了定量见解。
