《Advanced Materials Interfaces》：Cholesterol-DNA Origami Nanostructures for Synthetic Lipid Rafts Induce Early T Cell Activation Signals
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本文介绍了一种创新的胆固醇-DNA折纸纳米结构（CNP），该结构能够在活T细胞膜上实现胆固醇的纳米级空间可控排布，从而形成“合成脂筏”。研究证明，高密度胆固醇排列的CNP可有效结合T细胞膜，形成大型极化聚集区，稳定有序脂膜域，并与脂筏相关蛋白flotillin-1共定位，促进T细胞受体（TCR）、Lck、LAT和CD45等关键信号分子的膜重组与物理分离，最终在无抗原刺激下诱导早期T细胞活化。此DNA折纸策略揭示了胆固醇纳米级排布在脂筏形成、膜相分离及蛋白重组中的重要作用。
1 引言
活细胞膜上存在富含胆固醇和鞘脂的微小动态纳米域，即脂筏。由于具有更有序、更厚且流动性较低的特性，脂筏有助于膜蛋白的空间组织并影响广泛的细胞信号事件。这些纳米尺寸的脂筏（10-200 nm）可通过蛋白质-蛋白质或蛋白质-脂质相互作用聚集形成较大（>300 nm）域，作为细胞信号平台。胆固醇是质膜液体有序（Lo）-液体无序（Ld）相分离的关键组分。虽然胆固醇驱动的大尺度液-液相分离（LLPS）在热力学平衡的模型膜中已被观察到，但在非平衡的细胞膜中进行此类观察和研究仍具挑战性。胆固醇在T细胞活化中的作用存在争议，它既可通过诱导TCR纳米簇化促进信号，也可通过稳定TCR非活性构象抑制信号。然而，由于在控制胆固醇空间分布方面存在方法学限制，局部胆固醇浓度对活细胞质膜LLPS及脂筏驱动的T细胞蛋白重组的影响仍知之甚少。
2 结果
2.1 用于胆固醇模式化的DNA折纸结构设计
研究团队采用DNA折纸方法构建了胆固醇附着片状DNA纳米结构（CNP）。该结构为边长约60 nm、高约6 nm的方形片层，可通过杂交多个短单链DNA订书钉与长ssDNA支架链折叠成所需几何形状。通过在四个角点的突出订书钉上杂交Cy5标记的ssDNA实现可视化。为实现在NP一侧特定位点的胆固醇锚定和精确模式化，设计了结合位点阵列，使突出ssDNA订书钉（DNA手柄）与胆固醇偶联DNA（Chol-DNA）形成稳定复合物，并加入辅助DNA以增强胆固醇锚的稳定性。每个NP最多可展示72个Chol-DNA，排成12行6列，胆固醇间距为3.5 nm至38.5 nm。胆固醇通过疏水相互作用与质膜脂双层结合。杂交Chol-DNA的估计高度为10.9 nm，为TCR（胞外域长约7 nm）在CNP下方自由扩散提供了足够空间。长linker的灵活性使每个胆固醇能自适应调整其在约60×60 nm2折纸结构内的位置，增加了多个胆固醇同时插入的概率，优化了集体疏水驱动力以确保稳定锚定。为控制胆固醇局部浓度，设计了含18、36或72个胆固醇的CNP（分别称为18-CNP、36-CNP、72-CNP）。透射电子显微镜（TEM）成像证实了NP的正确折叠和高组装产率，并证明了CNP与合成小脂质体表面结合的能力。
2.2 T细胞膜上合成脂筏的形成
研究比较了CNP附着于质膜的两种策略：顺序反应和预组装单步反应。结果显示，单步反应的标记效率更高。CNP结合在两种反应条件下均诱导了微米级极化簇（合成脂筏）的自发形成。无胆固醇的对照NP不结合Jurkat T细胞膜，而胆固醇偶联的CNP均有效结合。标记效率在36-CNP和72-CNP间相当，18-CNP略有下降。但膜上极化簇的形成程度随胆固醇数量增加而渐进式增加。72-CNP主要形成明显的单极化合成脂筏，而18-CNP更常表现为均匀膜标记或形成较小、定义不清的簇。在标准细胞培养条件下评估CNP诱导的合成脂筏稳定性，发现72-CNP处理的细胞中极化CNP帽在4小时后仍可见，而大多数18-CNP和36-CNP从细胞上解离。CNP不影响Jurkat和人原代T细胞的增殖。72-CNP同样能在新鲜分离的小鼠和人原代T细胞以及分化的效应T细胞中诱导脂筏形成，这些合成脂筏在4小时内基本保持完整。
2.3 合成脂筏稳定质膜的有序相
研究利用对极性敏感的荧光探针C-laurdan量化72-CNP结合的T细胞的膜脂流动性和有序度。通过比较CNP结合（筏区）和非结合（非筏区）质膜区域的广义极化（GP）值，发现筏区的GP值显著高于非筏区。CNP结合区与非结合区之间的平均GP差值为0.081，接近合成磷脂膜中存在胆固醇时观察到的GP变化（0.1-0.15）。这表明CNP在膜上的分离稳定了脂域的Lo相，从而导致T细胞质膜的微尺度相分离。
2.4 合成脂筏增强并稳定Flotillin-1的极化
研究监测了CNP诱导的合成脂筏与脂筏相关蛋白flotillin-1（Flot1）的空间组织和动力学。在稳定表达Flot1-Halo的Jurkat T细胞中，72-CNP添加后，Flot1的极化显著增强。CNP诱导的合成脂筏与Flot1帽显著共定位。通过将细胞膜亚区划分为CNP结合（筏区）和非结合（非筏区）区域，计算发现筏区内Flot1中位强度平均值是非筏区的3倍。利用荧光漂白恢复（FRAP）分析72-CNP和Flot1在Jurkat T细胞膜上的侧向迁移率，发现合成脂筏中72-CNP荧光在光漂白后5分钟内几乎无恢复，而Flot1荧光缓慢恢复。CNP结合（筏区）Flot1的扩散系数（D）显著低于非结合（非筏区）Flot1。实时成像揭示了CNP成簇和Flot1极化的三种动态结果：CNP诱导先前未极化细胞的Flot1共簇化；CNP向预先存在的Flot1帽聚集；CNP优先结合弱极化Flot1帽并增强其极化。总之，CNP介导的合成脂筏与Flot1强共定位，且CNP结合进一步增强Flot1极化并稳定其运动性。
2.5 合成脂筏重组膜蛋白并诱导早期T细胞活化
研究评估了CNP介导的合成脂筏是否影响T细胞早期信号中膜蛋白的重排。首先评估了CD45在CNP结合后的分布。84%的CNP极化细胞中，CD45分子与合成脂筏分离。筏区内CD45中位强度平均值仅为非筏区的33%。CD45与72-CNP之间的负皮尔逊相关系数（R’ = -0.57）和近乎零的曼德斯重叠系数（MOC = 0.04）表明二者相互分离。其次，研究了合成脂筏是否能像免疫突触（IS）核心的TCR簇聚一样招募TCR。81%的CNP极化细胞中，在CNP极化合成筏区观察到CD3富集。筏区内CD3中位强度平均值是非筏区的5倍。此外，在稳定表达GFP标记Lck或LAT的Jurkat T细胞中，观察到Lck-GFP和LAT-GFP在CNP诱导的合成脂筏内积累。72-CNP处理显著增加了Jurkat T细胞和人原代效应T细胞中磷酸化ZAP-70（p-ZAP-70）的水平。流式细胞术分析显示，72-CNP处理显著增加了Jurkat T细胞中CD69+细胞群，其水平与PMA/离子霉素处理样品无显著差异。而在静息T细胞中，CNP处理 alone 未诱导CD69表达显著变化，但与TCR信号结合时，CNP对T细胞活化显示出协同效应。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，与Dynabead激活的T细胞不同，CNP处理的细胞在孵育24小时后未检测到IL-2和IFN-γ分泌。这些结果表明，胆固醇的作用仅限于T细胞活化的早期阶段。
3 讨论
本研究应用DNA纳米技术创建了活T细胞膜上的合成脂筏，有效驱动脂相分离、膜蛋白分离和早期T细胞活化。CNP诱导的膜极化在4小时内可检测到，该时间窗口足以捕获和分析T细胞活化的早期事件。DNA折纸CNP平台允许精确、简便地控制胆固醇在DNA折纸表面的数量、距离或排列，模拟纳米尺寸脂筏单体。CNP结合诱导膜的大尺度LLPS，形成合成脂筏。NP上多个胆固醇分子阵列促进了其与T细胞膜的稳健稳定结合，增加了局部胆固醇浓度。较高胆固醇数量的CNP更有效地驱动膜域分离，表明局部胆固醇浓度的变化改变了热力学平衡，促进了活细胞膜中的大尺度相分离。该合成脂筏与天然脂筏蛋白Flot1共定位，并招募TCR、Lck和LAT，同时排斥CD45，从而诱导早期T细胞活化。研究结果直接证明了胆固醇在活T细胞膜脂筏形成及其参与关键膜蛋白重组中的作用。研究表明，脂筏的形成足以根据膜蛋白对这些域的偏好来重组它们。研究观察到约67%的CD45在未形成APC紧密接触的情况下被排除在合成脂筏之外，这支持了脂筏驱动的CD45分离机制。CNP与T细胞上预组装的Flot1帽高度共定位，表明胆固醇局部浓度的增加可以启动和增强Flot1的组装。CNP结合后Flot1迁移率的显著降低表明，外叶的胆固醇浓度可以诱导与相邻质膜内叶的跨双层耦合。研究策略可用于在各种细胞类型中控制胆固醇的空间分布，并可扩展至包括鞘脂或其他蛋白质在内的脂筏其他主要组分。DNA纳米结构可能为设计能够独立于特定抗原控制T细胞免疫反应的新型分子疗法带来启示。
