基于微波辅助皂化与超声辅助酶解结合UPC2-APCI-MS/MS技术的婴幼儿配方奶粉中多种脂溶性维生素快速检测方法的开发与验证

《Journal of Food Composition and Analysis》：Development and validation of microwave-assisted saponification and ultrasonic-assisted enzymolysis for UPC2-APCI-MS/MS detection of several fat-soluble vitamins in infant formula

本研究针对婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素（FSVs）因化学性质差异大、基质复杂导致传统前处理方法效率低、回收率不高等问题，开发了一种结合微波辅助皂化（MAS）与超声辅助酶解（UAE）的超高效合相色谱-大气压化学电离串联质谱（UPC2-APCI-MS/MS）检测方法。该方法实现了维生素A、D2、D3、E（通过MAS）以及维生素K1、K2（通过UAE）的高效提取，回收率达96.84%-106.4%，显著缩短了前处理时间，为婴幼儿配方奶粉的质量控制提供了一种快速、高效的解决方案。

　　

在婴幼儿成长的关键阶段，配方奶粉作为母乳的重要替代品，其营养成分的准确性与安全性至关重要。脂溶性维生素（Fat-Soluble Vitamins, FSVs），包括维生素A、D、E、K，是维持婴幼儿正常生理功能所必需的微量营养素。然而，婴幼儿配方奶粉基质复杂，且不同类型的FSVs化学性质迥异：维生素A、D₂、D₃、E能够耐受碱性条件，而维生素K₁和K₂则在碱性和加热条件下极易降解。这种差异性使得传统单一的前处理方法（如热皂化）难以同时高效提取所有FSVs，往往导致某些维生素回收率低、检测结果不准确，成为婴幼儿配方奶粉质量控制和营养成分评估中的一个技术瓶颈。此外，常规检测方法如高效液相色谱（HPLC）虽然应用广泛，但面对复杂基质和多种目标物同时检测时，可能存在分析时间长、分离效率不够理想或与质谱兼容性不佳等问题。因此，开发一种能够针对不同性质FSVs进行高效前处理，并结合快速、高灵敏度检测技术的分析方法，对于确保婴幼儿配方奶粉的质量安全和营养价值具有重要意义。相关研究成果发表在《Journal of Food Composition and Analysis》上。

为攻克这一难题，研究人员设计并优化了一套结合两种针对性前处理技术与先进色谱-质谱联用的分析策略。关键技术方法主要包括：1） 针对碱耐受的维生素A、D₂、D₃、E，采用微波辅助皂化（MAS）进行快速提取和水解；2） 针对碱不稳定的维生素K₁、K₂，采用超声辅助酶解（UAE）进行温和高效的释放；3） 利用超高效合相色谱（UPC²）结合大气压化学电离串联质谱（APCI-MS/MS）对六种FSVs进行快速分离与高灵敏度、高选择性检测。实验使用了市售的婴幼儿配方奶粉实际样品以及美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准参考物质（SRM 1849a）进行方法验证。

3.1. Heating saponification optimization

研究人员首先对传统加热皂化条件进行了优化。通过考察碱用量、提取剂体积、温度和时间等因素发现，2.0 mL氢氧化钾溶液、80°C皂化60分钟、并用10 mL正己烷提取两次，可使维生素A、D₂、D₃、E获得较高回收率（85.92%-101.1%），但维生素K₁和K₂的回收率即使优化条件后仍很低（约52.11%-66.89%），证实了皂化法不适用于碱敏感性维生素K的提取。

3.2. Optimization of microwave-assisted saponification (MAS)

为解决传统皂化法耗时较长和对碱敏感维生素不适用的问题，研究人员开发了MAS方法。通过优化温度、时间和碱用量，确定在90°C、反应5分钟、使用3.0 mL氢氧化钾溶液的条件下，维生素A、D₂、D₃、E的回收率可达96.84%-102.6%。MAS利用微波的内部加热效应，极大缩短了皂化时间（从60分钟降至5分钟），并实现了目标维生素的完全释放。

3.3. Optimization of ultrasonic-assisted enzymolysis (UAE)

针对维生素K₁和K₂，研究人员优化了UAE条件。结果表明，以异辛烷为提取剂，使用500 mg脂肪酶，在超声场辅助下酶解60分钟，维生素K₁和K₂的回收率分别达到99.85%和97.93%。超声辅助显著加快了酶解过程（从至少120分钟缩短至60分钟），避免了热和碱对维生素K的破坏。

3.4. Optimization of analytical conditions

在分析条件优化方面，研究发现采用HSS C₁₈色谱柱，以超临界CO_{2和甲醇-异丙醇（2:3, v/v）为流动相，在2100 psi背压和2 μL进样量下，六种FSVs获得了良好的色谱行为。与电喷雾电离（ESI）相比，APCI离子源对FSVs的响应高出3-6倍，更适用于UPC²的流动相体系。通过添加0.1%甲酸的甲醇溶液作为补偿液（0.5 mL/min），进一步提高了电离效率。尽管维生素D2和D3色谱分离不佳，但通过多反应监测（MRM）模式选择特异性离子对，实现了准确定量。}

3.5. Method validation

方法验证结果表明，六种FSVs在10.0-1000.0 μg/L浓度范围内线性良好（R²≥0.9975），检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.5-10.0 μg/L和5.0-35.0 μg/L。加标回收率在96.85%-106.4%之间，日内和日间精密度（RSD）分别为1.22%-5.49%和1.94%-12.5%。使用同位素内标可有效校正基质效应，使其范围校正至95.33%-106.4%，保证了方法的准确性。

3.6. Application of the method for real sample analysis

将所建立的方法应用于市售六种婴幼儿配方奶粉和一种儿童成长配方奶粉的实际样品分析，并与中国国家标准（GB）方法及NIST 1849a标准物质进行对比验证。结果显示，实测值与标准方法结果基本一致，与NIST标准物质的认证值相对偏差较小（-6.8%至2.8%），证明了方法的可靠性和实用性。分析发现，不同品牌奶粉中FSVs含量存在差异，即使符合国家标准，仍需严格监控。儿童配方奶粉中检出了维生素D₂和K₂，而婴儿配方奶粉中未检出，反映了不同年龄段产品的营养强化差异。

本研究成功开发并验证了一种结合MAS和UAE前处理与UPC²-APCI-MS/MS检测的创新方法，用于同时测定婴幼儿配方奶粉中的六种FSVs。该方法通过针对不同维生素的化学特性采用特异性前处理策略，有效解决了复杂基质中碱耐受和碱敏感性维生素共存带来的分析挑战。MAS将皂化时间从60分钟大幅缩短至5分钟，UAE将酶解时间从至少2小时缩短至60分钟，显著提高了前处理效率。UPC²-APCI-MS/MS方法展现了良好的线性、灵敏度、准确度和精密度，并能有效克服色谱共流出问题。实际样品分析结果证实了该方法在婴幼儿配方奶粉质量控制中的实用价值，为快速、准确评估其营养成分提供了一种强有力的技术手段，对保障婴幼儿食品安全和营养健康具有重要意义。