《Journal of Thermal Biology》：Impact of cryotherapy on airway stenosis:
In vivo,
ex vivo, and
in vitro studies
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本研究针对良性中央气道狭窄(BCAS)治疗后易复发这一临床难题，创新性地将球囊扩张术与冷冻消融技术联合应用。通过猪模型体内实验、离体组织分子分析及人肺成纤维细胞(MRC-5)体外实验，首次系统揭示冷冻疗法通过抑制TGF-β1信号通路，显著降低胶原蛋白I/III、纤维连接蛋白及α-SMA等纤维化标志物表达，并抑制成纤维细胞迁移能力，从而有效延缓气道再狭窄进程。该研究为冷冻疗法的临床应用提供了坚实的机制依据，发表于《Journal of Thermal Biology》。
当气道因为各种原因变窄，呼吸就会变得异常困难，这正是良性中央气道狭窄（Benign Central Airway Stenosis, BCAS）患者面临的日常挑战。这种疾病可能由气管插管、气管切开等医源性操作引发，也可能源于肉芽肿性多血管炎、结节病等炎症性疾病，或是结核等感染性疾病以及气道支架置入或手术吻合后的并发症。虽然手术切除是首选治疗方法，但许多患者因身体状况无法耐受手术，此时内镜下介入治疗成为重要选择，包括球囊扩张、电灼、氩等离子体凝固(APC)、激光治疗、支架置入和冷冻疗法等。然而，传统热消融技术如电灼、APC和激光治疗在解除狭窄的同时，也可能损伤气道黏膜和软骨，导致瘢痕组织形成和再狭窄，使得治疗陷入“扩张-再狭窄-再扩张”的循环。
在这种临床困境下，冷冻疗法展现出独特优势。与传统热消融不同，冷冻疗法利用极低温达到治疗目的，分为基于粘附的冷冻疗法和基于组织/细胞破坏的冷冻消融。前者利用冷冻探头尖端在潮湿环境中快速冷却时与周围组织粘附的特性，用于活检、肿瘤切除、气道再通以及异物、血块和黏液栓的清除；后者则通过冻融循环过程中的细胞内和细胞外结晶及血栓形成造成细胞损伤，实现组织灭活。尽管临床研究显示冷冻消融治疗BCAS具有较高的缓解率，但其作用机制至今不明。
为了解决这一科学问题，来自韩国蔚山大学医院的研究团队开展了一项综合性研究，旨在探讨冷冻消融是否能有效预防狭窄复发，并深入揭示其细胞分子机制。研究团队创新性地采用体内、离体、体外三种研究模型相互印证：通过猪气管狭窄模型进行体内疗效评估，对猪气管样本进行离体组织学和分子生物学分析，并利用人肺成纤维细胞(MRC-5)进行体外细胞机制研究。
关键技术方法概述
研究采用十二周大雌性农场猪(体重40-45kg)建立气管狭窄模型，通过气管内套囊过度充压(200-400mmHg，40-60分钟)和电灼相结合的方式诱导狭窄。14只狭窄模型猪分为两组：单纯球囊扩张(BD)组和球囊扩张联合冷冻消融(BD+C)组，每组7只。冷冻消融使用柔性冷冻探头，在四个周向位置(3、6、9、12点钟方向)各进行三个30秒冻融循环。通过每周支气管镜和CT随访评估狭窄进展，终点时取气管标本进行组织病理学评分(炎症、上皮剥脱、纤维化)以及蛋白质印迹(Western blot)和定量RT-PCR(qPCR)分析纤维化标志物(胶原蛋白I/III、纤维连接蛋白、α-SMA、TGF-β1)。体外实验使用TGF-β1诱导的MRC-5细胞，模拟冷冻处理后评估纤维化标志物表达(Western blot、qPCR、免疫细胞化学)和细胞迁移能力(划痕实验)。
研究结果
冷冻消融对猪气管狭窄的体内影响
尽管样本量有限导致统计学差异不显著，但BD+C组在干预后呈现一致性优势。至研究终点(PID28)，BD+C组气管直径(12.7±0.9mm)显著大于BD组(8.0±1.5mm)，狭窄程度(50.7±7.9%)明显低于BD组(74.0±10.1%)，效应值(Hedges' g)达1.75，表明冷冻消融具有延缓狭窄进展的强烈趋势。BD+C组生存时间(中位数21天)也长于BD组(中位数12天)。
猪气管组织病理学变化
组织学分析显示，BD组表现为严重中性粒细胞炎症、肉芽组织大量形成、上皮完全剥脱和严重纤维化。相比之下，BD+C组仅见轻度中性粒细胞炎症、局灶性上皮剥脱和轻度纤维化。半定量评分证实，BD+C组的炎症(1.3±0.2 vs 2.0±0.3)、上皮剥脱(1.2±0.4 vs 2.8±0.2)和纤维化(1.2±0.2 vs 2.5±0.2)评分均显著降低，累积组织病理学评分(3.7±0.5 vs 7.3±0.5)差异极显著，效应值达2.81。
猪气管纤维化相关标志物表达
蛋白质印迹分析显示，BD+C组胶原蛋白I(1.2±0.1 vs 3.1±0.4)、胶原蛋白III(0.7±0.4 vs 3.9±0.4)、纤维连接蛋白(1.0±0.2 vs 2.4±0.2)、α-SMA(1.3±0.3 vs 3.2±0.3)和TGF-β1(1.0±0.4 vs 3.8±0.6)蛋白表达均低于BD组，效应值介于2.45-3.69。qPCR结果与此一致，mRNA水平上各标志物在BD+C组均显著下调，尤其TGF-β1 mRNA表达降低达5.1倍(0.3±0.1 vs 1.7±0.4)。
冷冻疗法对TGF-β1处理的MRC-5细胞的影响
体外实验进一步证实了冷冻疗法的抗纤维化机制。在TGF-β1诱导的MRC-5细胞中，冷冻处理显著降低胶原蛋白I(0.4±0.1 vs 0.9±0.1)和α-SMA(0.4±0.1 vs 0.9±0.0)蛋白表达，mRNA水平也呈现相同趋势。免疫细胞化学显示冷冻处理后胶原蛋白I(红色)和α-SMA(绿色)荧光强度显著减弱。功能上，冷冻处理细胞的迁移能力大幅受损，划痕实验24小时后的间隙闭合率仅为28.8±6.5%，远低于未处理细胞的79.3±2.9%。
研究结论与意义
本研究通过多模型验证，首次系统阐明冷冻消融治疗BCAS的分子机制。研究表明，球囊扩张后辅助冷冻消融能够通过抑制TGF-β1这一关键纤维化调节因子，下调细胞外基质成分(胶原蛋白I/III、纤维连接蛋白)和肌成纤维细胞标志物(α-SMA)的表达，并抑制成纤维细胞迁移，从而延缓气道纤维化进程和再狭窄发生。
这一发现不仅为冷冻疗法在BCAS治疗中的临床应用提供了坚实的科学依据，也拓展了人们对低温生物学效应的认识。与传统热消融技术相比，冷冻消融能够更好地保留细胞外基质结构，可能促进更理想的愈合并降低再狭窄风险。此外，研究中揭示的TGF-β1通路调控机制可能具有更广泛的生物医学意义，为其他纤维化疾病(如皮肤瘢痕疙瘩、器官纤维化)的治疗提供新思路。
尽管本研究存在样本量有限、未设置单纯冷冻治疗组等局限性，但其体内趋势与离体、体外显著结果的汇聚证据，为冷冻消融的抗纤维化作用提供了多模态支持，为未来更大规模的验证性研究奠定了坚实基础。这项研究标志着我们对冷冻疗法作用机制的理解迈出了重要一步，为优化BCAS治疗策略提供了新的理论框架和实践方向。
