《Journal of Virological Methods》：Development of a strand-specific RT-qPCR assay for detecting and quantifying Borna disease virus RNAs in infected cells
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博卡病毒1（BoDV-1）通过单链RT-qPCR技术实现基因组、抗原体和mRNA的特异性检测与定量分析，揭示其感染细胞时抗原体与基因组比例稳定在1:10，而mRNA比例随感染扩散逐渐下降，表明病毒通过调控RNA合成维持持续感染。
金田武宏 | 服部茂树 | 小森野亮 | 富永敬三
京都大学生命与医学科学研究所病毒研究部RNA病毒实验室
摘要 Borna病病毒1型（BoDV-1）是一种非分段负链RNA病毒（NSV），能够在多种哺乳动物物种的中枢神经系统中持续存在。鉴于近期有报道指出BoDV-1与人类致命性脑炎有关，因此需要更深入地了解其病毒生命周期。与其他NSV类似，BoDV-1在感染细胞中会产生三种类型的病毒RNA：基因组RNA、抗原组RNA和mRNA。虽然常规的逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）方法可用于检测病毒RNA，但由于逆转录（RT）反应过程中存在引物无关的cDNA合成，该方法无法区分这三种RNA类型。在本研究中，我们开发了一种链特异性RT-qPCR（ssRT-qPCR）方法，该方法在RT反应中使用了一种5’端带有非病毒标签序列的RT引物。该方法能够成功区分并定量这三种类型的BoDV-1 RNA。此外，利用该方法我们测量了BoDV-1 RNA在细胞内的动态变化，发现BoDV-1可能通过控制转录而非复制来建立和维持持续感染。总体而言，这种新型的ssRT-qPCR方法是研究BoDV-1生命周期的强大工具。
引言 Borna病病毒1型（BoDV-1）属于Bornaviridae科Orthobornavirus属的典型代表（Rubbenstroth等人，2021年）。BoDV-1是一种高度嗜神经性的病毒，能够感染多种哺乳动物，如家畜和绵羊，并引发称为Borna病的神经系统症状（Kinnunen等人，2013年；Richt和Rott，2001年）。关于BoDV-1对人类的感染性和致病性，多年来一直存在争议。然而，2018年在一名因脑炎死亡的年轻健康患者以及三名接受受感染供体器官移植的受者体内检测到了BoDV-1抗原和RNA（Korn等人，2018年；Schlottau等人，2018年）。此外，在一项回顾性研究中，从1999年至2019年间保存的56名脑炎患者的脑组织样本中发现了8例BoDV-1阳性病例（Niller等人，2020年）。最新报告显示，至少有46名患者死于BoDV-1相关的脑炎（Ebinger等人，2024年）。这些发现表明BoDV-1是一种可能引发人畜共患病的病原体，因此需要采取公共卫生措施（Rubbenstroth等人，2019年）。
BoDV-1的基因组由8.9 kb的非分段负链RNA组成，编码至少6个病毒基因（Briese等人，1994年；Tomonaga等人，2002年）。核蛋白（N）包裹病毒基因组和抗原组，形成病毒核衣壳。大蛋白（L）是一种依赖RNA的RNA聚合酶，与其辅因子磷蛋白（P）共同构成病毒聚合酶复合体。核衣壳和聚合酶复合体共同构成病毒核糖核蛋白（vRNP），这是病毒复制和转录所需的最小组成部分（Perez等人，2003年；Schneider等人，2003年）。病毒进入细胞后，vRNP释放到细胞质中，并迁移到细胞核内进行复制和转录（Briese等人，1992年；Cubitt和de la Torre，1994年）。在感染细胞中，BoDV-1合成三种类型的病毒RNA：基因组RNA、互补抗原组RNA和mRNA。基因组RNA作为病毒mRNA和全长抗原组RNA转录和复制的模板；抗原组RNA则作为全长基因组RNA复制的模板（Tomonaga等人，2002年）。有趣的是，虽然病毒RNA合成在感染早期较为活跃，但在感染后期会受到抑制，这表明BoDV-1能够精确控制病毒RNA的数量以建立持续感染（Ibrahim等人，2002年；Mizutani等人，1999年）。然而，这些发现基于Northern blot实验的结果，而该实验的定量能力有限。因此，要准确了解BoDV-1的细胞内生命周期，明确每种病毒RNA的分子动态变化至关重要。
逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）是检测和定量病毒RNA的标准方法。然而，与其他RNA病毒一样，即使使用病毒特异性的RT引物，常规RT-qPCR方法也无法区分这三种RNA类型，因为RT反应过程中存在引物无关的cDNA合成（Feng等人，2012年；Kawakami等人，2011年；Tercero等人，2019年；Timofeeva和Skrypina，2001年；Tuiskunen等人，2010年）。为了解决这一问题，已经为多种RNA病毒开发了链特异性RT-qPCR方法，例如甲型流感病毒（Kawakami等人，2011年）、裂谷热病毒（Tercero等人，2019年）和狂犬病病毒（Xiang等人，2025年）。在这种方法中，RT反应使用带有5’端非病毒标签序列的标记RT引物进行；qPCR则使用与标记RT引物中的标签序列相同的前向引物和与目标病毒序列互补的反向引物进行。因此，即使发生引物无关的RT反应，也只有带有5’端标签序列的RT引物依赖的cDNA会在后续的qPCR步骤中被扩增，从而能够检测到特定链的病毒RNA。对这三种病毒RNA的链特异性定量有助于详细评估病毒的转录和复制过程，进而阐明持续感染的分子机制以及宿主与病毒之间的相互作用。此外，量化抗原组RNA的生成量可以精确测量感染细胞内的复制效率，这有助于验证抗病毒药物的效果，并观察感染细胞中的增殖和传播动态。尽管ssRT-qPCR是一种强大的工具，但目前尚未适用于BoDV-1。
在本研究中，我们开发了一种针对BoDV-1 RNA的ssRT-qPCR方法。利用该方法，我们发现在整个感染过程中BoDV-1的抗原组RNA与基因组RNA的比例约为1:10。相比之下，随着病毒感染在细胞群体中的扩散，病毒mRNA与基因组的比例逐渐降低。据我们所知，这是首次对BoDV-1感染过程中所有三种病毒RNA的细胞内动态变化进行定量测量。
部分内容 病毒RNA标准的体外 合成 由于体外 合成约8.9 kb的BoDV-1基因组RNA或抗原组RNA在技术上较为困难，我们通过连接BoDV-1基因组或抗原组5’端和3’端各1,200 bp的片段来制备合成RNA标准（表1）。为了构建编码相应病毒序列的质粒，我们使用编码全长BoDV-1 cDNA的质粒（pREVec，Kanda等人，2021年）通过PCR扩增了所需的DNA片段。
针对BoDV-1 RNA的ssRT-qPCR方法的开发 为了逆转录全长基因组和抗原组，我们在基因组或抗原组的3’非翻译区设计了相应的标记RT引物，因为这些区域在BoDV-1不同菌株间高度保守（图1）。对于病毒mRNA，选择编码N基因（N mRNA）的mRNA作为检测目标，因为N mRNA是BoDV-1感染细胞中最丰富的mRNA之一（Kojima等人，2019年）。在N mRNA的3’端设计了标记RT引物。
讨论 在本研究中，我们开发了一种新型的ssRT-qPCR方法，能够利用5’端带有非病毒标签序列的RT引物区分并定量三种类型的BoDV-1 RNA：基因组RNA、抗原组RNA和mRNA。尽管该方法无法区分抗原组RNA和N mRNA，但可以通过从N mRNA的拷贝数中减去抗原组RNA的拷贝数来间接估算N mRNA的绝对拷贝数。
资金来源 本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）（T.K.的JP23K14083和JP25K18813项目；K.T.的JP20H05682、JP24K22131和JPJSCCA20240006项目）、日本医疗研究开发机构（AMED）（K.T.的JP23bm1223017h0001项目）、Kaketsuken研究基金（K.T.）、京都大学生命与医学科学研究所联合使用/研究中心计划（LiMe，K.T.）以及京都大学LiMe基金2024年和2025年项目的支持。
作者贡献声明 金田武宏： 撰写初稿、验证、项目管理、资金获取、数据分析、概念构建。服部茂树： 撰写、审稿与编辑、数据管理。小森野亮： 撰写、审稿与编辑、监督、方法设计、概念构建。富永敬三： 撰写、审稿与编辑、监督、资金获取。
致谢 我们衷心感谢京都大学的牧野明子博士和东京大学的松户宏道博士提供的宝贵建议和技术支持。同时，我们也感谢Editage（
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