Sec8通过抑制p53-STUB1轴稳定RIG-I正调控抗RNA病毒天然免疫的新机制

《Cell Death & Disease》：Sec8: a novel positive regulator of RIG-I in anti-RNA viral defense

本研究针对RNA病毒感染中RIG-I信号通路的精细调控机制这一关键科学问题，揭示了外泌体复合物亚基Sec8在抗病毒天然免疫中的新功能。研究人员发现，Sec8能通过抑制转录因子p53的表达及其磷酸化，进而下调E3泛素连接酶STUB1的转录；同时，Sec8通过与STUB1竞争性结合RIG-I的2CARD结构域，阻遏STUB1介导的RIG-I在K190位点的K48连接多聚泛素化及蛋白酶体降解，从而稳定RIG-I蛋白，增强I型干扰素（IFN-I）信号应答，最终抑制RNA病毒复制。该研究阐明了Sec8正调控抗病毒免疫的双重分子机制，为开发靶向抗病毒策略提供了新视角。

　　

在病毒与宿主持续博弈的漫长演化过程中，我们的身体装备了一套精密的“雷达”系统——天然免疫系统，用于快速识别并清除入侵的病原体。其中，维甲酸诱导基因I（RIG-I）作为细胞内一种重要的模式识别受体（PRR），如同哨兵一般，能够敏锐地侦测到病毒复制过程中产生的特定RNA分子，进而启动一系列信号传导，最终诱导I型干扰素（IFN-I）和大量干扰素刺激基因（ISGs）的产生，构筑起强大的抗病毒防线。然而，这条信号通路必须被精确调控，其活性不足会导致宿主易受病毒感染，而过度激活则可能引发自身免疫性疾病。因此，揭示RIG-I活性的精细调控机制，一直是免疫学领域的前沿和热点。已知多种E3泛素连接酶，如RNF125、TRIM40等，可通过介导RIG-I的K48连接多聚泛素化，促使其被蛋白酶体降解，从而负向调控抗病毒反应。STUB1也被报道是其中之一，但其具体的调控细节及上游调控因子仍有待深入探索。另一方面，外泌体复合物作为细胞内囊泡运输的关键调控者，其不同亚基被发现在病毒复制与宿主防御中扮演着复杂多样的角色，而其中Sec8的功能在抗RNA病毒天然免疫中却鲜为人知。正是基于这一背景，山东师范大学赫洪斌和王红梅团队在《Cell Death & Disease》上发表了他们的最新研究成果，系统阐述了Sec8如何作为一个新型的正向调控因子，通过一条新颖的p53-STUB1轴来稳定RIG-I，从而增强抗病毒免疫反应。

为阐明Sec8在抗RNA病毒免疫中的作用，研究人员综合运用了分子与细胞生物学、免疫学以及基因编辑动物模型等多种关键技术。这些方法包括利用基因敲除/敲低（通过CRISPR/Cas9和shRNA技术构建Sec8条件性基因敲除小鼠（Lyz2-Cre Sec8^fl/fl）以及Sec8、RIG-I、STUB1稳定敲除的HeLa细胞系）、双荧光素酶报告基因检测（分析IFN-β启动子、ISRE活性及STUB1启动子活性）、免疫共沉淀（Co-IP）与蛋白质印迹（Western Blot）（分析蛋白质相互作用、泛素化修饰及蛋白表达水平）、染色质免疫共沉淀（ChIP）（验证p53与STUB1启动子的结合）、实时定量PCR（qPCR）（检测基因mRNA表达）以及病毒滴度测定（TCID₅₀）等。研究还使用了从Sec8^fl/fl和Lyz2-Cre Sec8^fl/fl小鼠分离的原代腹腔巨噬细胞（PMs）和骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）进行功能验证。

Sec8正向调控RNA病毒诱导的IFN-I信号通路

研究人员首先在传代细胞（HeLa）中发现，过表达Sec8能显著增强水疱性口炎病毒（VSV）、新城疫病毒（SeV）感染或低分子量聚肌胞苷酸（LWM poly(I:C)，RIG-I激动剂）刺激后IFN-β、ISG54和ISG56的mRNA水平以及IFN-β启动子和干扰素刺激反应元件（ISRE）的活性；反之，敲低Sec8则产生相反效果。为了在更接近生理条件的模型中进行验证，他们利用CRISPR/Cas9技术构建了髓系细胞特异性敲除Sec8的小鼠（Lyz2-Cre Sec8^fl/fl）。从该小鼠模型分离的PMs和BMDMs在受到VSV感染或LWM poly(I:C)刺激后，其IFN-I及其下游效应基因的诱导表达水平均显著低于对照小鼠（Sec8^fl/fl）来源的细胞。这些结果在细胞和动物水平均证实，Sec8是RNA病毒触发的IFN-I信号通路的一个关键正调控因子。

Sec8通过上调RIG-I促进IFN-I信号传导

为了探究Sec8的作用靶点，研究人员通过双荧光素酶报告基因实验发现，Sec8的过表达能特异性增强由RIG-I过表达所激活的IFN-β和ISRE启动子活性，而对MDA-5、MAVS、TBK1或组成型激活的IRF3（IRF3-5D）触发的信号没有影响。进一步的蛋白质水平分析显示，过表达Sec8能够提高VSV、SeV感染或LWM poly(I:C)刺激后细胞内源性RIG-I的蛋白水平，并促进IRF3的磷酸化；而敲低Sec8则导致RIG-I蛋白水平下降和IRF3磷酸化减弱。在Sec8缺陷小鼠的巨噬细胞中也观察到了类似的现象。这些数据表明，Sec8很可能是通过作用于RIG-I来正向调控IFN-I信号的。

Sec8通过阻断STUB1介导的RIG-I K190位点泛素化来阻止其蛋白酶体降解

机制探索表明，Sec8敲低并不影响RIG-I的mRNA水平，但会加速RIG-I蛋白的降解。这种降解可被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转，而自噬-溶酶体途径抑制剂氯喹（CQ）则无此效果，提示Sec8主要通过泛素-蛋白酶体途径影响RIG-I稳定性。深入的泛素化分析发现，Sec8能特异性抑制VSV感染条件下RIG-I的K48连接的多聚泛素化，而对其K63等其他连接类型的泛素化无影响。通过筛选，研究人员将目标锁定在E3泛素连接酶STUB1上，发现敲低Sec8会上调STUB1的蛋白水平，而过表达STUB1则会加剧Sec8敲低引起的RIG-I降解。更重要的是，他们通过点突变实验首次鉴定出RIG-I蛋白的第190位赖氨酸（K190）是STUB1介导的K48连接泛素化及降解的关键位点。Sec8能够抑制STUB1对野生型RIG-I的K48连接泛素化，但对K190R突变体无效。在RIG-I基因敲除细胞中回补实验进一步证实，Sec8只能稳定野生型RIG-I，而对K190R突变体无稳定作用。这些结果清晰地表明，Sec8通过抑制STUB1介导的RIG-I在K190位点的K48连接泛素化来阻止其被蛋白酶体降解。

Sec8通过降低p53蛋白水平抑制STUB1的mRNA表达

有趣的是，研究人员发现Sec8不仅能影响STUB1的蛋白水平，还能在转录水平上抑制STUB1。过表达Sec8剂量依赖性地降低STUB1的mRNA水平，而敲低Sec8则提升其mRNA水平。通过启动子截短分析和生物信息学预测，并结合功能实验验证，他们发现转录因子p53是连接Sec8与STUB1转录的关键桥梁。Sec8的过表达能抑制p53的总蛋白水平及其Ser33位点的磷酸化（与p53转录活性密切相关），而敲低Sec8则产生相反效应。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验直接证实p53能结合到STUB1基因启动子区（-210至+1 bp），且Sec8敲低增强了这种结合。突变预测的p53结合位点后，p53对STUB1启动子的激活作用消失。功能挽救实验表明，抑制p53的磷酸化（使用抑制剂PFT-α）或敲低p53本身，均可逆转由Sec8敲低引起的STUB1上调。这些结果证明，Sec8通过抑制p53的表达和磷酸化，进而抑制p53作为转录因子对STUB1的转录激活，最终降低STUB1的mRNA和蛋白水平。

Sec8通过与STUB1竞争性结合RIG-I的2CARD结构域来稳定RIG-I

除了转录调控，研究人员还发现了Sec8稳定RIG-I的另一条直接机制。免疫共沉淀实验证实，Sec8不仅能与RIG-I相互作用，也能与STUB1结合。通过构建结构域缺失突变体，他们发现Sec8和STUB1都特异性地与RIG-I的2CARD结构域结合，而Sec8则需要完整的STUB1才能与之相互作用。竞争性实验显示，过表达Sec8会抑制STUB1与RIG-I的结合，而敲低Sec8则促进二者的结合。为了排除Sec8通过下调STUB1表达间接影响其与RIG-I结合的可能性，研究人员在STUB1基因敲除细胞中重新导入恒定表达的STUB1，结果发现即使在这种情况下，Sec8的敲低仍然能增强STUB1与RIG-I的相互作用。这表明Sec8确实能够通过与STUB1竞争性结合RIG-I的2CARD结构域，直接阻碍STUB1对RIG-I的识别和降解。

Sec8在体外通过抑制p53-STUB1-RIG-I轴来抑制RNA病毒复制

功能上，细胞水平的病毒学实验表明，过表达Sec8能降低VSV和SeV的mRNA水平及病毒滴度，而敲低Sec8则促进病毒复制。在RIG-I基因敲除细胞中的回补实验证明，Sec8的抗病毒作用依赖于RIG-I，并且特异性依赖于其K190位点（因为回补RIG-I-K190R突变体后，Sec8失去了抗病毒效果）。更重要的是，在Sec8敲低的细胞中，通过同时敲低STUB1或抑制p53活性（PFT-α处理），可以挽救被削弱的IFN-β反应，并抑制因Sec8缺失而增强的病毒复制。这充分说明Sec8是通过抑制p53-STUB1-RIG-I轴来发挥其抗病毒功能的。

Sec8缺失在体内更有利于RNA病毒复制

最后，动物实验证实了Sec8的生理重要性。与Sec8^fl/fl对照小鼠相比，髓系细胞特异性敲除Sec8的小鼠（Lyz2-Cre Sec8^fl/fl）在静脉感染VSV后，其脾脏、肝脏和肺脏中IFN-β、ISG54和ISG56的诱导表达显著降低，血清中IFN-β蛋白水平也明显下降。相应地，缺陷小鼠各器官中的病毒载量更高，肺部病理损伤（如肺泡壁增厚、充血水肿）更为严重。在病毒感染后的生存分析中，Sec8缺陷小鼠的体重恢复更慢，且存活率显著低于对照小鼠。这些体内实验数据强有力地证明，Sec8的缺失会削弱宿主对RNA病毒的免疫防御能力，导致病毒复制加剧、病理损伤加重和生存率下降。

结论与意义

该研究系统地阐明了Sec8作为一个新型的正向调控因子，在抗RNA病毒天然免疫中发挥着至关重要的作用。其创新性主要体现在以下几个方面：首先，首次将外泌体复合物亚基Sec8的功能拓展至抗病毒天然免疫领域，揭示了其不同于其他亚基的独特作用。其次，发现了一条全新的p53-STUB1调控轴，其中p53作为STUB1的转录因子这一功能属首次报道。第三，精细定位了STUB1介导RIG-I降解的关键泛素化位点为K190，丰富了RIG-I的翻译后修饰图谱。最后，揭示了Sec8通过“双重保险”机制稳定RIG-I：既在转录水平上抑制p53/STUB1轴，又在蛋白质水平上与STUB1竞争性结合RIG-I。这项研究不仅深化了对RIG-I信号通路精细调控网络的理解，也为未来开发针对病毒性疾病（尤其是RNA病毒感染）的新型治疗策略（例如，靶向增强Sec8功能或干扰STUB1活性）提供了潜在的理论依据和新的分子靶点。