《Ecological Entomology》：Two Metschnikowia nectar yeast species have similar volatile profiles but elicit differential foraging in bee pollinators
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本研究发现，尽管Metschnikowia reukaufii和M. koreensis两种花蜜酵母的挥发性有机化合物（VOC）谱高度相似，但田间试验显示蜜蜂对接种M. koreensis花朵的访问率显著高于无菌花蜜，而对M. reukaufii则无显著偏好。该研究通过整合野外调查、行为观察和化学分析，揭示了酵母物种特异性在植物-传粉者-微生物互作网络中的关键作用，为昆虫-微生物共生机制研究开辟了新视角。
引言
花蜜作为许多昆虫和部分脊椎动物的关键能量来源，近年来被认识到是古菌、原生生物、病毒、细菌和酵母等重要微生物的栖息地。这些微生物群落进一步介导植物与昆虫之间的相互作用。研究表明，微生物依赖昆虫媒介在花蜜中定殖，当花蕾与传粉者隔离时，其微生物群落稀疏且不与昆虫相关的花蜜微生物重叠。昆虫与酵母尤其具有古老而多样的共同进化历史，酵母挥发物通常在昆虫吸引以建立共生关系中发挥关键作用。
尽管花蜜因高糖度引起的渗透胁迫、低氮可用性和竞争排斥而对微生物构成恶劣环境，但特化的酵母和细菌能够在花蜜中达到高密度。就真菌而言，野外调查显示单个酵母物种通常主导花蜜群落，这可能是由于强烈的竞争和优先效应、扩散限制、载体关联以及花蜜环境引起的环境过滤所致。花蜜中最常鉴定的酵母物种包括花蜜专家Metschnikowia reukaufii和Metschnikowia gruessi，以及通用菌Aureobasidium pullulans和Cryptococcus及Candida物种。基于迄今为止的研究，M. reukaufii是最普遍的花蜜酵母，至少在花蜜研究最多的温带地区是如此。
材料与方法
花蜜酵母调查
研究团队于2021年9月至2022年6月期间，在美国北卡罗来纳州罗利和教堂山机会性地采样了103朵不同物种的漏斗形花朵。选择性地采样漏斗形花朵是因为蜜蜂，尤其是熊蜂，经常访问这种形状的花朵，并且花结构允许以最小的植物组织污染进行花蜜采样。使用网袋套住开放花朵以防止传粉者访问并允许花蜜积累。大约24小时后收集花蜜。如果单朵花无法收集至少2.5μL花蜜，则合并同一植株上多朵花的花蜜作为一个样本。
花蜜样本从微量毛细管中挤出到100μL无菌水中，涡旋混合后在酵母蛋白葡萄糖培养基上培养。从每个平板上采样颜色、大小和纹理不同的单个酵母菌落。使用靶向内部转录间隔区区域的引物通过聚合酶链反应筛选菌落以鉴定酵母物种。最终序列上传至GenBank。
花蜜酵母对昆虫传粉者行为的影响
从花蜜调查中选择两种最丰富的酵母物种M. reukaufii和M. koreensis的克隆，评估其对传粉者行为的影响。酵母最初在YPD琼脂上培养，然后接种到灭菌的人工花蜜培养基中。将酵母培养物用无菌人工花蜜稀释至1×104细胞/μL的浓度，以与报道的花蜜中酵母细胞浓度范围保持一致。
使用植物Pentas lanceolata进行田间行为测定。将植物盆栽并施肥。在每次试验前，计数并记录每株植物上的花朵数量。使用移液器，根据处理分配，将4μL无菌人工花蜜或酵母接种的人工花蜜放入每朵花中。将植物放入交错的田间阵列后开始试验观察。记录每个访花事件的植物ID、访问的花朵数量以及每朵花上的取食持续时间。
分析了四个蜜蜂访花指标：访问的植物数量、每株植物访问的花朵比例、访问率以及每朵花的访问持续时间。使用线性混合效应模型分析无菌或酵母接种人工花蜜对这些指标的影响。
挥发性有机化合物谱
通过固相微萃取收集从花蜜调查中收集并用于传粉者行为测定的M. reukaufii和M. koreensis菌株的挥发物，并使用气相色谱-质谱联用进行分析。酵母培养物按照上述方法生长和稀释，修改之处是将培养物在无菌人工花蜜中稀释至总体积10mL，浓度为1×104细胞/μL以增加SPME的挥发物产量。
排除仅在一个重复中发现的11种化合物，留下18种化合物。计算每个样品的总峰面积。使用主成分分析可视化从M. reukaufii和M. koreensis收集的挥发物化合物的组成。使用基于Bray-Curtis相异性的置换多元方差分析检验两种酵母物种VOC谱的差异。
结果
花蜜酵母调查
在103个独特的花蜜样本中，33.98%含有酵母。研究发现Metschnikowia酵母主导了当地调查的花蜜群落，所有鉴定酵母中90.7%属于Metschnikowia属。其中，花蜜专家Metschnikowia reukaufii被确定为最常出现的酵母物种。然而，M. koreensis、M. gruessi和M. rancensis也很常见。鉴定出8例酵母共现情况，通常发生在M. reukaufii和另一种Metschnikowia物种之间。最常见的共现是M. reukaufii和M. gruessi，其次是M. reukaufii和M. koreensis。
花蜜酵母对昆虫传粉者行为的影响
当呈现用M. reukaufii处理或无菌花蜜的植物时，蜜蜂传粉者表现出相似的植物访问数量、探花比例和访问率。相比之下，蜜蜂传粉者增加了对补充了M. koreensis接种花蜜的花朵和植物的访问率，超过用无菌花蜜处理的。用M. koreensis处理导致蜜蜂重复在花朵上取食，酵母处理的花朵访问了128%的花朵，而无菌花蜜仅探花54%。用任一种酵母物种接种花蜜对花朵访问持续时间没有影响。
挥发性有机化合物化学谱
尽管观察到的传粉者行为存在差异，但M. reukaufii和M. koreensis的挥发物谱在很大程度上重叠，基于PERMANOVA的峰面积比例没有统计学差异。在M. reukaufii和M. koreensis产生的18种挥发性化合物中，16种是两种物种共有的，只有两种化合物由单一物种产生。对于M. koreensis独有的两种化合物，没有一种是气味 bouquet 的主要成分。两种酵母物种都有12个已鉴定的峰在所有五个重复中都存在。大多数挥发物是伯醇，其次是酯、酸、甲基酮和仲醇。
讨论
本研究旨在连接多个生物组织层次，进一步了解当地花蜜中存在哪些酵母及其是否以及如何影响传粉者的觅食决策。研究结果提供了美国东南部花蜜酵母存在和物种组成的一些首批信息。结果与之前其他地区的研究一致：M. reukaufii通常是花蜜中最主要的酵母。然而，观察到花朵内多种酵母物种频繁共现。最常见的共现是M. reukaufii与M. gruessi，这反映了之前在欧洲采样的花蜜中的发现。
可以假设一种情景，即花朵中最常见的酵母也是对传粉者最具吸引力的酵母，其普遍性部分源于其吸引传粉者从而进行携播扩散的能力。然而，在本研究中，最常见的酵母M. reukaufii对传粉者的吸引力并不比无菌花蜜大。相反，一种较不普遍的物种M. koreensis与无菌花蜜相比显示出更强的传粉者吸引力。如果传粉者是酵母扩散的主要方法，我们的结果对M. reukaufii群落优势的方法提出了有趣的问题。M. reukaufii可能具有适应能力，使其能够在花蜜中胜过其他酵母，即使与其他酵母物种共同引入，也能主导花蜜资源。
我们预计两种酵母物种都会比无菌花蜜更能吸引蜜蜂访客，但情况并非如此。虽然越来越多的证据记录了蜜蜂对接种酵母的花朵相对于无菌花蜜的偏好，但这种模式并非普遍存在。我们的结果与Rering, Beck, Hall等人以及Good等人的结论一致，其中熊蜂和蜜蜂分别对无菌花蜜和接种M. reukaufii的花蜜没有表现出觅食差异。传粉者选择背后的机制仍然难以捉摸。蜜蜂传粉者持续更频繁地取食补充了M. koreensis的花朵而非无菌花蜜，表明与酵母相关的嗅觉线索可能引导蜜蜂找到接种花蜜。
昆虫-真菌共生是一个古老而丰富的生态相互作用网络，范围从纯粹兼性到完全专性。昆虫和酵母都必须有强大的进化压力来维持这些共生关系。事实上，产生昆虫吸引化学物质是许多酵母的保守且通常必要的特征。一类有趣的此类化学物质是乙酸酯，由醇乙酰转移酶产生。Metschnikowia物种有8-9个推定的醇乙酰转移酶，这些基因是气味差异潜在分子机制的有趣靶点。未来阐明花蜜酵母-蜜蜂传粉者相互作用的遗传基础的工作，如化学信号、花蜜代谢和病原体干扰，将导致对昆虫-酵母共生机制和演变的新发现。
