《The FEBS Journal》：Regulation of PHOX2B gene expression by the long non-coding natural antisense RNAPHOX2B-AS1
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本综述系统阐述了PHOX2B基因的反义长链非编码RNA——PHOX2B-AS1的鉴定、表达调控及其功能。研究揭示了PHOX2B与PHOX2B-AS1之间存在严格的正向相互调控关系：PHOX2B蛋白可反式激活PHOX2B-AS1的转录，而PHOX2B-AS1则在翻译水平上正调控PHOX2B蛋白的表达。这种在转录因子基因座中存在的双向转录与相互调控机制，为理解先天性中枢性低通气综合征（CCHS）、赫希施普龙病（HSCR）和神经母细胞瘤（NB）等PHOX2B相关疾病的病理机制提供了新的视角。
PHOX2B-AS1的基因组结构与双向转录
PHOX2B基因编码一个对自主神经系统（ANS）发育至关重要的转录因子。本研究聚焦于其基因座上一个新近注释的长链非编码自然反义转录本（lncNAT）——PHOX2B-AS1。该反义RNA与PHOX2B基因以头对头（5‘端相对）的方式排列，其转录起始位点位于PHOX2B基因的第一个内含子内，部分序列与PHOX2B mRNA的第一个外显子互补重叠。研究在人和小鼠中均鉴定出PHOX2B-AS1转录本，并发现其核心重叠区域在物种间高度保守。实验证实，在神经母细胞瘤细胞系（如IMR32）和人脑组织（如脑桥和延髓）中，存在多种PHOX2B-AS1的剪接变体。
PHOX2B与PHOX2B-AS1的表达谱与共表达
表达分析显示，PHOX2B-AS1的表达与PHOX2B呈现出显著的正相关。在表达PHOX2B的神经母细胞瘤细胞系（如SK-N-BE(2)C, IMR32, SH-SY5Y）和正常人脑组织中均可检测到PHOX2B-AS1，而在不表达PHOX2B的细胞系和组织中则检测不到。值得注意的是，在神经母细胞瘤细胞中，PHOX2B的表达水平远高于PHOX2B-AS1。利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）定向分化为交感神经元的模型，研究发现PHOX2B和PHOX2B-AS1在分化过程中呈现同步的时序表达模式。此外，能够下调PHOX2B mRNA水平的药物，如全反式维甲酸（ATRA）和孕激素活性代谢物3-酮-去氧孕烯（3-KDG），同样能降低PHOX2B-AS1的表达，进一步支持了二者表达的协同性。
PHOX2B正向调控PHOX2B-AS1的转录
研究对PHOX2B-AS1的启动子区域进行了功能分析。荧光素酶报告基因实验表明，在PHOX2B阳性的神经母细胞瘤细胞中，PHOX2B-AS1启动子具有转录活性。更重要的是，共转染实验证明PHOX2B蛋白能够反式激活PHOX2B-AS1启动子的活性。然而，与先天性中枢性低通气综合征（CCHS）相关的PHOX2B突变体（如+7丙氨酸和+13丙氨酸扩展突变）则丧失了这种激活能力。染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）数据进一步证实，PHOX2B蛋白可结合于PHOX2B-AS1启动子区域。在可诱导敲低PHOX2B的细胞模型中，PHOX2B的下调初期也伴随着PHOX2B-AS1表达的降低，这为PHOX2B正向调控PHOX2B-AS1的转录提供了直接证据。
PHOX2B-AS1在翻译水平正调控PHOX2B
为了探究PHOX2B-AS1的功能，研究使用GapmeR反义寡核苷酸（ASO）在IMR32细胞中敲低PHOX2B-AS1。结果发现，虽然PHOX2B-AS1的敲低对PHOX2B的mRNA水平影响不大，但却显著降低了PHOX2B的蛋白水平。这提示PHOX2B-AS1在翻译水平上正调控PHOX2B的表达。RNA原位杂交（RNAscope）和细胞组分RNA-seq分析表明，PHOX2B-AS1转录本在细胞核和细胞质中均有分布，但主要定位于细胞质，这为其参与转录后调控提供了细胞定位基础。
讨论与展望
本研究首次详细刻画了PHOX2B基因的反义转录本PHOX2B-AS1，并揭示了一个PHOX2B与PHOX2B-AS1之间复杂的双向正反馈调控环路：PHOX2B在转录水平激活PHOX2B-AS1的表达，而PHOX2B-AS1则在翻译水平促进PHOX2B蛋白的合成。这种精细的调控机制对于维持PHOX2B蛋白的稳态至关重要，而PHOX2B的剂量敏感性已在多种疾病中得到证实。PHOX2B-AS1的发现为理解PHOX2B相关疾病（如CCHS、HSCR和NB）的分子机制开辟了新途径。例如，在神经母细胞瘤中，靶向PHOX2B-AS1以间接降低致癌因子PHOX2B的蛋白水平，可能成为一种潜在的治疗策略。而在CCHS中，PHOX2B基因的突变（尤其是多聚丙氨酸重复扩展突变，PARMs）可能通过破坏这种双向调控环路，导致更复杂的病理表现。未来研究需要进一步阐明PHOX2B-AS1精确的分子作用机制，并评估其作为疾病生物标志物或治疗靶点的潜力。
