《Materials Today》：A material toolbox for engineering targeted lipid nanoparticles for RNA therapies
引言
核糖核酸（RNA）疗法正迅速重新定义现代医学的格局，为在基因水平上靶向疾病提供了可编程的解决方案。其成功，以美国FDA批准的siRNA药物和临床使用的mRNA疫苗为例，主要得益于脂质纳米粒（LNP）的实现，LNP能够保护RNA，促进其细胞内递送，并增强内体逃逸。然而，LNP表现出有限的器官选择性，常常在肝脏积聚，这限制了其更广泛的临床转化。本综述提出了一个以材料为中心的框架，用于设计靶向LNP，以提高靶向器官的治疗效果，同时最大限度地减少脱靶效应。
LNPs的表面工程化：主动靶向配体
一种广泛采用的靶向LNP设计策略涉及使用各种靶向配体修饰LNP表面，例如抗体、肽、适配体、碳水化合物或小分子。即使最小量的这些配体也能有效地介导向靶细胞的选择性递送。聚乙二醇（PEG）-脂质特别适合表面功能化，因为其末端可以很容易地在LNP制剂后进行功能化，以与配体结合。或者，配体可以预结合到脂质尾部或胆固醇锚定物上，并在LNP制剂过程中加入，或者未结合的配体可以通过非共价相互作用在LNP合成后附着。
化学方法将靶向配体工程化到LNPs上
为了促进配体在LNP表面的掺入，通常使用反应性基团——例如胺、羧酸、叠氮化物、二苯并环辛炔（DBCO）、硫醇、马来酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯。许多带有这些基团的PEG-脂质是可商购的，并且易于在标准制剂过程中掺入LNP，从而能够在制剂后温和的水性条件下实现有效的靶向配体结合。其中一些温和而高效的反应利用了这些LNP表面暴露的反应性基团。点击化学反应，尤其是无铜的应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）和硫醇-马来酰亚胺迈克尔加成，因其在生物相容性条件下的高收率和选择性而被广泛使用。硫醇-马来酰亚胺化学适用于具有半胱氨酸残基的蛋白质配体，游离硫醇也可以通过N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）或使用三(2-羧乙基)膦（TCEP）或二硫苏糖醇（DTT）进行二硫键还原来引入。通过酰胺或酯键的共价结合，通常使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）或在NHS存在下使用HATU，也可以应用。此外，非共价相互作用，包括超强亲和力的抗生物素蛋白-生物素结合或静电相互作用，也为配体的LNP表面功能化提供了有效的模块化策略。这些多样化的化学策略为用各种靶向部分定制LNP表面提供了一个灵活的平台，从而能够根据结合配体的亲和力实现向特定细胞类型或组织的精确递送。
尽管这些化学方法具有多功能性，但临床可扩展性和良好生产规范（GMP）生产需要显著的改进。广泛用于抗体附着的硫醇-马来酰亚胺结合在控制结合方向和实现LNP间均匀的配体密度方面面临挑战。在规模化生产中，需要严格的过程控制以确保批次间的一致性并防止聚集。表面功能化也会改变LNP的物理化学性质和稳定性。由添加庞大表面配体（如抗体）驱动的LNP尺寸变化——范围从仅几纳米到超过100纳米——会影响体内的循环半衰期和组织渗透，并且超过约200纳米的颗粒有引发补体激活和快速清除的风险。不均匀的配体附着可能会增加多分散指数（PDI），因此需要控制结合以保持一致的产品质量。此外，因为用配体结合的PEG-脂质替换过多的未修饰PEG-脂质会破坏胶体性质，大多数靶向LNP制剂保留一部分未修饰的PEG-脂质以保持空间稳定性。而且，配体展示改变了免疫系统对LNP的识别方式；抗体修饰的LNP暴露片段可结晶（Fc）区域，这可能增加调理作用和单核吞噬系统（MPS）清除，促使使用无Fc片段或纳米抗体。
抗体结合的LNPs
抗体是强大的靶向部分，因为它们具有特征性的三维结构和对特定抗原的极高亲和力（nM–pM范围）。因此，它们通常用于将LNP导向特异性表达或在表面过表达靶抗原的特定细胞。免疫球蛋白G（IgG）同种型在临床前研究中通常被优选，因为其在循环中的稳定性和长半衰期。
全长抗体提供强大的二价结合，使其适用于LNP表面功能化。例如，H. C. Geisler等人通过将抗表皮生长因子受体（EGFR）抗体通过DBCO-叠氮点击化学结合到LNP表面，开发了EGFR靶向的LNP，并证明增强了mRNA向胎盘的递送。与未靶向制剂相比，靶向LNP在表达EGFR的滋养层细胞中显示出mRNA表达和摄取增加约两倍，突出了抗体结合LNP在实现肝外、组织特异性核酸递送方面的前景。
尽管全长抗体赋予了LNP靶向性，但其大尺寸（约150 kDa）可能增加LNP尺寸并减少细胞摄取，并且其Fc结构域可能引发免疫反应。较小的抗体片段如Fabs（片段抗原结合区，约50-60 kDa）和scFvs（单链可变片段，约25-30 kDa）可降低LNP免疫原性并改善组织渗透。例如，A. Kheirolomoom等人和M. M. Billingsley等人报道，与马来酰亚胺-PEG脂质结合的抗CD3 F(ab')2片段能够选择性递送mRNA到CD3+T细胞，实现有效的CAR-T生成。
抗体主要通过其半胱氨酸或赖氨酸残基上的游离硫醇或胺分别共价结合到LNP表面。虽然有效，但抗体的这种直接化学修饰可能导致异质结合，并可能影响抗体的稳定性和结合。为了规避这一点，D. Peer小组开发了ASSET（锚定次级scFv实现靶向）方法，并采用共价锚定在LNP上的次级scFv以非共价方式结合靶向抗体，允许在不改变抗体结构的情况下灵活掺入。创新的抗体捕获系统现在无需化学修饰即可实现靶向抗体的快速筛选，如M. Z. Chen等人所展示的，他们开发了一个纳米抗体锚定平台，用于T细胞和其他细胞类型的即插即用靶向。
诸如批次间变异性和结合化学计量控制有限等挑战仍然是临床转化的障碍，需要进一步的方法学调整。尽管如此，抗体结合的LNP有望介导精确的肝外核酸递送。
肽结合的LNPs
与抗体类似，肽是由氨基酸组成的生物分子，但它们的尺寸通常要小得多（<5 kDa）。这种小分子量允许在LNP上实现更高的表面密度、改善的组织渗透、降低的免疫原性以及通过固相合成进行成本效益高的大规模生产。尽管靶点结合亲和力通常低于抗体（nM–μM范围），但肽配体仍为许多LNP应用提供了足够的特异性。例如，E. L. Han等人通过硫醇-马来酰亚胺化学将肽——RVG29（30聚体）、T7（7聚体）、mApoE（13聚体）和angiopep-2（20聚体）——结合到马来酰亚胺-PEG脂质上，创建了脑靶向LNP。这些肽识别各种脑内皮和神经元受体，包括烟碱型乙酰胆碱受体、转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体（LDLR）和LDLR相关蛋白（LRP-1）。其中，RVG29结合的LNP在全身给药后表现出最有效的mRNA向神经元的递送，并减少了脱靶肝脏积聚。肽的稳定性可以通过D-氨基酸或针对肽酶介导降解的化学修饰来改善。此外，肽可以直接合成具有反应性末端，用于定向结合到PEG-脂质。D. Cao等人也证明，与SR-57227衍生的可电离脂质结合的反式激活因子（TAT）细胞穿透肽（CPP）能够实现稳健的脑mRNA递送， achieving >50倍高于临床LNP的脑表达。结合TAT介导的转胞吞作用和5-HT3受体结合的双重靶向策略克服了血脑屏障（BBB）的限制。在胶质母细胞瘤模型中，OS4T LNP有效递送了白细胞介素12（IL-12）mRNA，验证了CPP结合平台用于中枢神经系统（CNS）治疗。
除了制剂后表面修饰，肽-胆固醇结合物也可以在制剂过程中直接掺入LNP，简化了过程。例如，G. Zhao等人设计了一种脂肽，通过包含GGGKKKGK和PEG4连接体的固相合成方法将靶向CD44的A6肽（KPSSPPEE）与胆固醇结合。当加载针对YAP和TAZ（细胞增殖的两个主调节因子）的siRNA时，这些靶向LNP在乳腺癌的斑马鱼异种移植和患者来源异种移植（PDX）模型中显著抑制了肿瘤生长。这些结果支持肽结合LNP作为一个有前景的组织靶向递送平台，并且蛋白水解稳定性、体内持久性和结合亲和力的增强可以进一步提高肽作为靶向配体的效用。
适配体结合的LNPs
适配体是能够折叠成独特三维结构的单链DNA或RNA寡核苷酸，能够以高特异性和亲和力结合特定细胞表面蛋白。尽管尺寸小（6–30 kDa; ～2 nm），适配体表现出纳摩尔范围的结合亲和力，这是由于与其靶点的立体特异性相互作用。它们可以通过固相合成化学合成，允许可扩展生产和易于的序列修饰。然而，它们的聚阴离子性质可能导致与血清蛋白的非特异性相互作用，并且它们对核酸酶降解的敏感性限制了体内稳定性。这些问题可以通过2'-O-甲基或2'-氟核苷酸修饰来解决。对于基因编辑应用，S. Sarkar等人将上皮细胞粘附分子（EpCAM）特异性适配体掺入LNP，以选择性地将CRISPR/Cas9质粒递送到过表达EpCAM的癌细胞，在免疫 competent 小鼠中导致有效的基因编辑和肿瘤生长抑制。因此，适配体结合的LNP为精确核酸递送提供了一个有前景的模块化策略，结合了核酸的化学多功能性和配体导向的特异性。其稳定性和体内性能的持续优化将是其临床转化的关键。
碳水化合物结合的LNPs
碳水化合物因其内源性来源、生物相容性、可变尺寸和最小免疫原性而成为有吸引力的靶向部分。在单糖中，甘露糖和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）被广泛用于靶向RNA-LNP递送。甘露糖部分能够靶向甘露糖受体（CD206），该受体主要存在于抗原呈递细胞（APC）上。为了利用这一途径，J. Lei等人用脂质尾部修饰甘露糖并将其掺入LNP制剂，通过CD206介导的内吞作用实现树突状细胞靶向。这种靶向增强了mRNA递送，使未靶向mRNA-LNP疫苗剂量的五分之一即可实现等效的抗肿瘤反应。除了主动靶向外，这些甘露糖修饰的LNP还通过CD206信号轴调节免疫检查点表达，促进T细胞活化。
GalNAc通过结合去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）实现肝脏特异性递送，该受体主要存在于肝细胞上。L. N. Kasiewicz等人将GalNAc修饰的PEG-脂质掺入LNP制剂，实现了向肝细胞的靶向递送。与依赖血清载脂蛋白E（ApoE）吸附和随后通过ApoE-LDLR途径摄取进行肝脏递送的传统LNP相比，这种ASGPR靶向方法提供了一个关键替代方案。在LDLR缺陷的非人灵长类动物模型中，这些LNP通过递送针对Angptl3基因的化脓性链球菌Cas9 mRNA和向导RNA，实现了肝脏基因编辑效率从5%到61%的显著增加，直接使LDLR缺陷患者受益。
在多糖中，透明质酸（HA）——一种由重复的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺单元组成的带负电荷、生物相容和可生物降解的聚合物——由于其对在肿瘤和免疫细胞上表达的CD44受体的特异性结合而经常用于主动靶向LNP。由于其负电荷，HA可以静电包被在阳离子LNP上。例如，P. Hardy小组报道了使用阴离子HA和阳离子聚-L-精氨酸的层层自组装包被LNP制剂。利用最外层的HA层进行CD44介导的靶向，他们成功递送了肿瘤抑制性microRNA-181a-5p，在皮下肿瘤模型中延迟了肿瘤进展。这些发现突出了碳水化合物配体在通过受体介导机制实现细胞类型特异性RNA递送方面的多功能性，尽管其广泛的凝集素结合潜力在最小化脱靶效应方面可能仍构成挑战。
小分子配体结合的LNPs
小分子配体（<1 kDa）包括天然化合物及其衍生物，如叶酸、双膦酸盐、苯硼酸和茴香酰胺。这些配体通过促进靶细胞中受体介导的内吞作用（例如，靶向转铁蛋白受体1的转铁蛋白配体）来增强基因递送。它们的小尺寸最小化了对LNP尺寸的影响，同时提高了组织渗透效率。这也能够实现多价表面展示，并且能够预结合到脂质上，消除了LNP形成后额外修饰的需要。此外，它们表现出低免疫原性。与抗体相比，小分子化学性质稳定，适合长期储存，然而它们可能表现出比抗体更低的结合亲和力和特异性。
在一项研究中，X. Han等人将茴香酰胺——一种已知靶向活化肝星状细胞的配体——结合到一种在LNP制剂中作为可电离脂质替代物的类脂质上。这些LNP有效递送了针对热休克蛋白47（HSP47）的siRNA，在肝纤维化模型中实现了约65%的敲低。在另一项研究中，L. Xue等人将具有骨钙高亲和力的双膦酸盐掺入可电离脂质用于骨靶向。这些LNP在静脉注射后增强了骨中的mRNA表达，优于非靶向LNP。由于其合成可及性和稳定性，小分子对于下一代LNP是有前景的。增强其靶标特异性和结合亲和力的持续努力将是扩展其近期临床应用的关键。
通过内在脂质设计和组成调控内源性器官趋向性
最近的研究表明，内源性靶向——意味着无需表面展示配体的器官选择性递送——可以通过内在的LNP设计来实现，包括合理的脂质设计、组分比例的调整以及添加性脂质的掺入。这些策略改变了物理化学性质，从而调节与血清蛋白和细胞膜的相互作用，并影响体内生物分布。
用于器官特异性递送的可电离脂质的开发
可电离脂质，占LNP的35–50 mol%，通过酸性条件下获得正电荷，在RNA封装和内体逃逸中起关键作用。在低pH值下制剂期间，阳离子可电离脂质与阴离子RNA结合，导致自组装和RNA封装。此外，在生理pH下保持中性的这些阳离子LNP在逐渐酸化的内体中与阴离子内体膜相互作用，诱导内体逃逸并将RNA释放到细胞质中。在结构上，它们由一个可电离的核心——通常是叔胺（例如，线性、杂环、单/多胺）——和具有不同饱和度、支化度和可生物降解性的疏水尾部组成。可电离核心主要决定了脂质的表观pKa，这是影响内体逃逸和细胞内递送效率的关键参数。
这些核心和尾部通常通过可生物降解的键（如酯、酰胺或碳酸酯）连接，增强了整体可生物降解性。例如，B. Li等人使用含有碳酸酯部分的硝基蓖麻醇酸丙烯酸酯连接体构建了一个包含720种可电离脂质的库，并鉴定出RCB-4-8作为用于肺靶向mRNA和CRISPR/Cas9递送的先导候选物。值得注意的是，S. Yoo等人使用维生素B5作为多功能骨架，能够形成酯键和酰胺键，产生了17种具有不同头尾构型的可电离脂质。包含维生素B5衍生的I97的LNP 5097有效地将mRNA递送到淋巴组织，并作为mRNA疫苗递送平台在小鼠肿瘤模型中实现完全肿瘤抑制。最近，Z. Liu等人开发了ecoLNPs，一个围绕喹啉支架合理设计并通过中心复合设计优化的氯喹样可电离脂质库，产生了具有强pH响应性内体破坏和高度高效的体内mRNA递送和基因组编辑的CF3-2N6-UC18 LNP。
可电离脂质开发的一个关键方面是，即使微小的结构变化也能显著影响器官趋向性、递送效率和治疗功效。因此，由结构-活性关系指导的合理设计结合经验性的体外和体内筛选对于优化器官靶向脂质至关重要。各种高通量筛选研究已经证明了这些结构细微差别的重要性。例如，H. Ni等人使用体内DNA条形码系统筛选了一个结构多样的128种基于哌嗪的LNP库，鉴定出LNP-A10对肝脏Kupffer细胞以及脾巨噬细胞和树突状细胞具有优先趋向性。在此基础上，合理的设计策略通常涉及构建具有轻微变体的结构相似脂质库以阐明结构-活性关系。例如，L. Xue等人筛选了一个252个硅氧烷基脂质库，并显示尾部化学（环氧化物/酯 vs. 酰胺）决定了肝脏与肺的递送，而阴离子变体倾向于脾脏。先导候选物（Si6-C14b, Si5-N14, 和 Si12-C10）在各自的靶器官中实现了高效的体内基因编辑和mRNA转染。
重要的是，可电离脂质在纳米颗粒组装之前合成，允许使用多样化和苛刻的化学方法——例如酰胺/酯偶联、环氧化物开环、迈克尔加成和Ugi多组分反应——从而能够微调其特性以实现靶向递送。L. Xue等人利用快速的希夫碱还原合成了来自12个胺核心和15个醛尾的180种可降解类脂质。他们的先导制剂LNP-CAD9选择性地将Cas9 mRNA和血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）sgRNA递送到荷瘤小鼠的肺内皮，减少了肿瘤生长并延长了生存期，而没有肝脏或脾脏积聚。这种合成灵活性拓宽了创建功能多样、器官选择性脂质的设计空间。
最近，人工智能（AI）已应用于可电离脂质设计。J. Witten等人在超过9,000个LNP活性数据点上训练了一个神经网络，以识别结构-功能关系，并利用模块化Ugi反应生成了一个包含160万种脂质的化学多样性计算机库。预测的前200名候选物被合成并在体内测试。值得注意的是，具有支链羧酸衍生物和萜烯衍生尾部的FO-32和FO-35，在气管内给药后能够将Cre mRNA功能性地递送到雪貂的肺部。
虽然AI驱动的方法通过能够预测结构-活动关系和大规模计算机筛选虚拟化学库来加速可电离脂质的发现，但必须解决几个关键的限制。首先，稳健的AI模型需要大型、高质量的实验数据集进行训练和验证。标准化、策划的LNP数据的有限可用性仍然是一个显著的瓶颈。当前的数据库包含120-1200种经过实验表征的可电离脂质，在标准化细胞系（如HeLa, RAW 264.7, HEK 293T）中测量了转染效率，并辅以制剂参数，如颗粒大小、ζ电位和摩尔比。特征工程整合了四种互补的模式：（1）物理化学分子描述符（表观pKa, LogP, 分子量, 拓扑极性表面积, HOMO-LUMO能量），（2）结构指纹（RDKit 2D指纹, 扩展连通性指纹, Morgan指纹, 和SMILES表示），（3）通过分子3D变换器捕获原子坐标和键拓扑的三维空间特征，以及（4）通过one-hot嵌入编码的多模式复合制剂参数。一种整合AI驱动发现与稳健实验验证的协同方法表明，在多样化特征集上训练的模型实现了85-98%的分类准确度和0.49-0.89的回归R2值，具体取决于数据分区策略。
接下来，深度学习模型的可解释性带来了监管挑战；因此，实施可解释AI（XAI）技术，如SHAP（SHapley Additive exPlanations）和LIME（Local Interpretable Model-agnostic Explanations），对于阐明脂质功效的结构基础至关重要。严格的验证采用支架分割和基于活动悬崖的数据分区——这些方法将结构相似的分子分离到不同的训练集和测试集中以评估真正的外推能力——结合k折交叉验证（通常5-10折）在75-80%的训练集上和外部验证在20-25%的保留测试集上。这防止了人为的性能膨胀，并确保模型能够泛化到训练域之外的新化学支架。最后，计算机预测必须通过实验研究进行严格验证，因为AI模型在没有直接实验确认的情况下通常无法准确预测结合行为和生物反应。未来，人工智能和机器学习的这种应用有望通过快速筛选 vast 库并提供对复杂结构-功能关系更深入的见解，显著加速LNP的合理设计和优化。
总之，可电离脂质的发展已经演变为一项多学科努力，整合了合理设计、经验筛选和合成化学。由可电离脂质实现的内源性靶向不需要制剂后修饰，并提供了在肝脏之外访问更广泛器官的潜力，强调了它们对未来临床RNA递送应用的强大前景。
通过脂质添加剂调控器官趋向性
引入第五种脂质添加剂已成为将LNP靶向特定组织的一种策略。这些趋向性导向脂质通常表现出独特的物理化学特性，例如改变的电荷状态，这可以影响与血清蛋白、细胞膜或组织特异性血管内皮的相互作用。
这一概念最突出的实施之一是D. J. Siegwart小组在2020年开发的选择性器官靶向（SORT）LNP。通过将基于电荷的SORT脂质引入传统的四组分LNP制剂，他们证明可以设计LNP表面电荷以调节mRNA递送的器官趋向性。他们报道，阳离子SORT脂质（例如DOTAP）、阴离子SORT脂质（例如18PA）和具有叔胺的可电离SORT脂质（例如，DODAP）分别增强了对肺、脾和肝的趋向性。值得注意的是，这些效应在各种LNP制剂中是可重复的，强调了SORT策略的多功能性。
SORT LNP的器官趋向性归因于它们对表观pKa和表面电荷的调节，这改变了蛋白质冠组成和下游与组织特异性内皮受体的相互作用。例如，靶向肝脏、肺和脾的LNP表现出不同的pKa谱（分别为6-7, >9, 和2-6），与其体内分布相关。在传统LNP中，LNP表面上的ApoE结合通过LDLR促进肝脏摄取。相反，S. A. Dilliard等人证明，SORT LNP的蛋白质冠在靶向肺和脾的制剂中分别富含玻连蛋白（Vtn; 总蛋白的12.2%）和β2-糖蛋白I（β2-GPI; 总蛋白的20.1%），通过与肺αvβ3整合素和脾吞噬细胞相互作用介导趋向性，同时减少的ApoE吸附最小化了肝脏积聚。从机制上讲，当肝脏、肺和脾趋向性SORT LNP分别与其相应的血清蛋白（ApoE, Vtn, 和β2-GPI）预孵育并应用于来自靶组织的富含受体的细胞时，细胞摄取增加了两倍多。当每个SORT LNP随后在不同浓度下与所有三种蛋白孵育时，仅在匹配的LNP-蛋白-细胞对中增强了mRNA表达，显示出与用于预孵育的蛋白量的清晰剂量依赖关系。这些发现表明SORT脂质驱动了 distinct 血清蛋白的选择性吸附，并且特定的蛋白-受体相互作用介导了受体依赖性内吞作用，从而实现了组织特异性mRNA递送。SORT LNP也在各种RNA cargo（包括siRNA和CRISPR/Cas9）中展示了脂质介导的器官特异性递送。
除了SORT框架，其他研究也利用第五种脂质成分来指导器官特异性递送。例如，X. Lian等人通过掺入带有1-2个官能团（例如，NHS酯）的共价脂质种类作为第五种成分，开发了靶向骨髓的LNP。这些LNP在各种小鼠模型中有效地将CRISPR/Cas9和碱基编辑器递送到骨髓细胞。类似地，S. H. Bae等人在基于SM-102的LNP中引入海藻糖糖脂，将趋向性从肝脏转移到淋巴器官，如脾和淋巴结。有趣的是，海藻糖和mRNA之间的氢键潜力允许替换多达一半的可电离脂质，减少了肝脏递送，并显著减弱了肝脏和心脏中的毒性标志物。
总的来说，这些发现突出了脂质添加剂在重编程LNP体内命运中的作用，为实现组织选择性核酸递送用于多样化治疗应用提供了一种通用且模块化的策略。
用于器官趋向性递送的一组分或两组分类脂质纳米组装体
与传统的三到五组分系统不同，最近的研究开发了仅由一或两种组分组成的极简类脂质纳米组装体。这些制剂主要由带有季铵或仲胺头基的类脂质化合物组成，胆固醇或辅助脂质作为唯一成分，并且显著缺乏PEG-脂质成分。与传统的基于叔胺的可电离脂质相比，仲胺和季铵增强的水溶性被假设为即使在未PEG化的情况下也能维持胶体稳定性。有趣的是，这些简化的组装体通常表现出 suppressed 肝脏递送。含有季铵的制剂显示出明显的肺趋向性，类似于阳离子SORT脂质，而仅含有仲胺的制剂主要积聚在脾脏。例如，M. Li等人报道，仅由一种仲胺 bearing 脂质（tB-UC18）和DOPE组成的纳米组装体，封装萤火虫荧光素酶mRNA，在小鼠静脉注射后，约95%的总发光信号在脾脏中实现。
最近的一组分和两组分类脂质纳米组装体证明，使用肽修饰的可电离脂质（PIL）和肽编码的器官选择性靶向（POST）平台的简化制剂可以实现器官选择性递送，同时在未PEG化的情况下保持胶体稳定性。通过将肽序列直接整合到脂质支架中，这些方法为组织趋向性建立了合理的设计规则，同时消除了对磷脂的传统依赖。两个平台都验证了极简制剂优于传统的四组分系统，代表了一种向简化制造和可预测的、设计驱动的器官靶向用于肝外mRNA治疗法的范式转变。
此外，具有固体mRNA包含核心的脂质体LNP（lipoLNPs）悬浮在由鞘磷脂-胆固醇双层包围的水性内部，通过减少血浆蛋白吸附和延长血液循环时间 compared to 传统LNP，实现了高效的肝外递送。这种结构方法保持了高mRNA封装和转染效率，同时克服了肝趋向性，表明脂质组装中的架构创新可以补充极简组分策略以实现器官选择性递送。这样的系统突出了脂质化学本身控制体内命运的潜力，为组织选择性RNA递送提供了一个简化的平台。
总之，上述四类内在脂质策略说明了如何通过合理控制脂质化学和组成来调节内源性器官趋向性。
靶向LNP效率的评估方法学
体外测定
筛选靶向LNP的体外主要方法涉及将报告基因封装在各种LNP制剂中，并评估靶细胞中的RNA递送效率。与体内研究相比，体外测定提供了一个更易访问和高通量的筛选平台，允许快速评估大量LNP候选物，同时验证设计的LNP是否实现其预期的RNA递送。为了评估选择性，可以包括来自主要器官的细胞与靶细胞一起，为靶向LNP提供阳性和阴性对照。
基于荧光和发光的体外测定因其便利性而被广泛使用。对于mRNA递送，荧光素酶、绿色荧光蛋白（GFP）和mCherry mRNA通常用于翻译报告蛋白。在荧光素酶测定中，在96孔板中用加载荧光素酶mRNA的LNP处理细胞，然后进行细胞裂解和D-荧光素盐添加；然后使用酶标仪定量发光，类似于成功的mRNA递送。虽然高效用于高通量筛选，但该方法缺乏单细胞分辨率。使用GFP或mCherry mRNA的流式细胞术能够进行单细胞分析，量化转染细胞的百分比和相对蛋白表达水平。
对于siRNA和ASO递送，通常在组成型表达荧光素酶或GFP的细胞中进行荧光素酶或GFP敲低测定。荧光标记的siRNA也允许通过流式细胞术直接测量摄取；然而，功能性基因沉默必须通过 northern blot, western blot, 或酶联免疫吸附测定（ELISA）进一步验证。
对于基于CRISPR/Cas的基因编辑，LNP通常封装Cas mRNA和sgRNA。在细胞摄取后，Cas mRNA被翻译成功能性蛋白，并在向导RNA序列提供的基因座介导基因编辑。因此，通常首先进行报告m
