利用多酶免疫金纳米探针和纳米通道电极的磁珠三明治免疫传感技术，实现对肿瘤生物标志物的高灵敏度电化学发光检测

《Microchemical Journal》：Magnetic-bead sandwich immunosensing with multienzyme immunogold nanoprobe and nanochannel electrode for sensitive electrochemiluminescence detection of tumor biomarker

信号-off电化学发光免疫传感平台通过磁性珠辅助的夹心识别策略和二氧化硅纳米通道电极，实现CEA的高灵敏度检测，检测范围达10fg/mL-100ng/mL，并具备电极可再生特性。

　　

赵路|史竹轩|席凤娜|周玉成

中国浙江省杭州市杭州医学院附属浙江省人民医院（浙江省人民医院）肿瘤中心胃肠与胰腺外科普通外科

摘要

敏感的肿瘤生物标志物检测对于早期癌症诊断、治疗监测和预后评估至关重要。本文开发了一种信号关闭型电化学发光（ECL）免疫传感平台，该平台结合了酶负载的免疫金纳米探针、基于磁珠的夹心识别技术和纳米通道修饰电极，能够实现癌胚抗原（CEA）的灵敏检测，以此作为概念验证。通过将二氧化硅纳米通道膜（SNF）功能化到低成本ITO电极上，制备出纳米通道电极，使得阳离子三(2,2′-联吡啶)钌(II)（Ru(bpy)₃²⁺）发射剂的静电富集成为可能，其ECL信号比裸露的ITO电极增强了119倍。金纳米颗粒（AuNPs）用于共负载葡萄糖氧化酶（GOD）和检测抗体（dAb），从而制备出GOD/dAb@Au纳米探针。在CEA存在下，带有捕获抗体（cAb）的磁珠选择性地结合目标分子，并与GOD/dAb@Au探针结合形成酶负载的夹心免疫复合物。施加外部磁场后，可以快速将免疫复合物从样品基质中分离出来。利用SNF/ITO电极和含有葡萄糖（Glu）的Ru(bpy)₃²⁺/三丙胺（TPrA）溶液，GOD催化产生的H₂O₂作为淬灭剂，以CEA依赖的方式降低ECL信号。该免疫传感器对CEA的检测范围为10?fg/mL至100?ng/mL，检测限（LOD）低至5.3?fg/mL。此外，该技术还实现了对胎牛血清中CEA的检测。此外，SNF/ITO电极可以再生并重复使用。

引言

肿瘤生物标志物的检测在癌症的早期诊断、治疗监测和预后评估中起着关键作用[1]、[2]、[3]。例如，作为广泛使用的肿瘤生物标志物，癌胚抗原（CEA）在表皮癌（如结直肠癌和乳腺癌）患者的血清中显著升高[4]。已经开发了许多利用抗原-抗体识别特异性的免疫测定平台用于CEA分析，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[5]、荧光免疫测定（FIA）[6]、表面等离子体共振（SPR）[7]和电化学发光（ECL）免疫测定[8]。尽管这些方法应用广泛，但FIA需要复杂的标记步骤且容易受到背景荧光的影响；SPR对基质组成和温度敏感；而传统ELISA的准确性受比色测量的限制，使得在非常低的抗原浓度下进行可靠定量变得困难。基于ECL的免疫测定最近受到了越来越多的关注。通过将电控激发与化学发光的高检测灵敏度相结合，ECL免疫传感器为低丰度生物标志物的检测提供了一种有吸引力的策略[9]、[10]、[11]。因此，开发一个稳健的ECL免疫传感平台对于实现CEA的灵敏检测非常重要。

基于磁珠（MBs）的免疫测定已成为肿瘤生物标志物检测的有效方法。MBs由超顺磁性纳米材料组成，可以使其表面共价且定向地附着捕获抗体。在特定抗原-抗体结合后，目标分子可以在外部磁场的作用下被有效富集并从样品基质中分离出来。这种配置具有两个主要优势：首先，磁分离可以去除来自复杂基质的干扰物，降低背景信号，为后续检测创造更清洁的环境；其次，MBs作为构建夹心型免疫测定和整合信号放大策略的坚固固相支持。已经报道了许多放大方法，包括酶辅助放大和多步骤级联方案[12]。例如，Xiao等人提出了一种使用可控酶联夹心结构的介孔二氧化硅辅助淬灭ECL免疫传感器[13]。在他们的设计中，碱性磷酸酶（ALP）产生酚，从而淬灭Ru(bpy)₃²⁺的ECL发射，实现检测。然而，酚具有高度细胞毒性，且每抗体仅标记一个酶的限制降低了淬灭效率，限制了整体的检测灵敏度。相比之下，由葡萄糖氧化酶（GOD）催化的葡萄糖（Glu）氧化产生的H₂O₂是更生物相容的Ru(bpy)₃²⁺淬灭剂[14]。此外，将酶加载到纳米载体上可以显著增加局部酶密度，进一步提高分析灵敏度[15]。在各种纳米载体中，金纳米颗粒（AuNPs）因其较大的比表面积、高的吸附能力和优异的生物相容性而经常被使用[16]。与传统的抗体-单酶偶联物相比，AuNPs可以容纳更多的酶，产生更多的催化产物，从而产生更显著的ECL变化[17]、[18]。因此，将抗体和多个酶分子共固定到AuNPs上，可以制备出适合高灵敏度免疫测定的酶联免疫金纳米探针。通过将基于MBs的磁分离与AuNPs的高酶负载能力相结合，可以构建出强大的ECL传感平台，为高灵敏度CEA检测提供强大潜力。

在电极表面引入抗污染和信号放大材料可以进一步提高目标检测的灵敏度[19]、[20]、[21]、[22]。特别是多孔材料在ECL传感中的电极修饰中越来越受到应用[23]。其中，二氧化硅纳米通道膜（SNF）作为一种化学稳定的薄膜，具有介孔纳米通道阵列，作为有效的抗污染和信号增强层而受到广泛关注[24]、[25]。SNF包含直径约为2–3?nm的明确纳米通道，可以阻止较大颗粒或蛋白质等物质的通过，从而在复杂样品分析过程中有效抵抗污染和基质干扰[26]、[27]。SNF上的硅醇基团的pKa约为2，在典型缓冲条件下发生去质子化，导致表面带负电荷[28]、[29]。当集成到ECL传感中时，SNF可以静电浓缩带正电的发射剂，即使在低发射剂水平下也能增强ECL响应，同时减少试剂消耗[30]、[31]、[32]。因此，分子筛分和电荷富集效应的结合使基于SNF的ECL系统能够实现信号增强和对样品干扰的更好耐受性。

在这项研究中，我们开发了一种信号关闭型ECL免疫传感平台，该平台结合了酶标记的免疫金纳米探针、磁珠辅助的夹心识别技术和SNF修饰电极，用于肿瘤生物标志物的检测。金纳米颗粒用于共固定检测抗体（dAb）和多个葡萄糖氧化酶（GOD）单元。这些多功能纳米探针旨在同时提供目标识别和酶促放大功能。在CEA检测过程中，带有捕获抗体的磁珠（MBs-cAb）选择性地结合分析物，随后与GOD/dAb@Au结合形成夹心型免疫复合物。借助磁珠的作用，这些免疫复合物可以通过外部磁场快速与游离的GOD/dAb@Au分离。对于信号读出，使用SNF修饰的氧化铟锡电极（SNF/ITO）作为检测接口，而含有Glu的Ru(bpy)₃²⁺/TPrA电解液用于产生ECL信号。SNF膜的负电荷纳米通道有助于有效富集阳离子Ru(bpy)₃²⁺发射剂，即使在低浓度下也能显著增强ECL信号。在免疫复合物内部，GOD催化葡萄糖（Glu）氧化产生H₂O₂，从而有效淬灭Ru(bpy)₃²⁺/TPrA的发射，实现CEA的信号关闭型检测。与传统单酶标记方法相比，GOD/dAb@Au探针显著提高了每个抗体的酶负载量，从而增强了放大效果和检测灵敏度。这种双抗体ECL策略避免了繁琐的电极修饰过程，并实现了电极的再生和重复使用，为高性能肿瘤生物标志物检测带来了巨大潜力。

部分摘录

化学与材料

与小鼠抗人CEA单克隆捕获抗体（MBs-cAb，4?mg?mL^?1）、癌胚抗原（CEA）、小鼠抗人CEA单克隆检测抗体（dAb）、C-糖抗原15-3（CA15-3）、反应蛋白（CRP）、α-胎蛋白（AFP）、C-糖抗原19-9（CA19-9）和葡萄糖氧化酶（GOD）来自北京Keyue Zhongkai Biotechnology有限公司。葡萄糖和三丙胺（TPrA）、氯金酸（HAuCl₄）由该公司提供。

双抗体夹心免疫传感器的构建和酶介导的信号关闭策略

图1展示了用于CEA分析的ECL免疫传感平台的构建和操作原理。如图1A所示，MBs-cAb、GOD/dAb@Au和CEA一起孵育，形成双抗体夹心复合物MBs-cAb/CEA/GOD/dAb@Au。孵育后，混合物经过磁分离，然后洗涤和重新分散以获得免疫复合物。SNF/ITO电极作为ECL转导接口。

结论

通过将酶负载的免疫金纳米探针与磁驱动的夹心识别过程和SNF修饰的纳米通道电极相结合，开发了一种信号关闭型ECL免疫传感平台。检测抗体和多葡萄糖氧化酶（GOD）共组装在AuNPs上，生成GOD/dAb@Au探针。带有捕获抗体的磁珠选择性地结合CEA，随后与GOD/dAb@Au探针结合形成酶负载的夹心复合物。

CRediT作者贡献声明

赵路：撰写——原始草稿、研究、数据管理。史竹轩：撰写——原始草稿、研究、数据管理。席凤娜：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。周玉成：撰写——审稿与编辑、方法学、资金获取。

未引用参考文献

[53]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（U25A20151和22374130）、浙江省健康产业科技重点项目（WKJ-ZJ-26026）以及浙江省健康科技项目（2023KY559）的财政支持。