《Progress in Biophysics and Molecular Biology》：Recent Advances in Targeting Regions of Interest for
In Situ Cryo-Electron Tomography of Cellular Architecture
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冷冻电子显微技术（cryo-ET）通过三维成像捕获原位细胞超结构，突破传统固定与染色局限，但受限于标本厚度、电子散射及结构异质性。近年通过整合冷冻聚焦离子束（FIB）磨削、冷冻共定位光电子显微镜（CLEM）靶向及亚结构平均（STA）等技术，显著提升分辨率与定位精度，尤其在膜结合细胞器、细胞骨架网络及粘附复合体分析中取得突破。当前挑战包括高分辨率与样本厚度的权衡、分子识别可靠性及多尺度数据的整合，未来需优化 vitrification 策略与自动化分析工具。
克里斯托弗·欧亨尼奥·威利姆（Christopher Eugenio Williem）| 维拉尼塔萨·斯蒂芬妮·希马万（Viranitasya Stephanie Himawan）| 梅克尔·T.E. 马纳万（Maykel T.E. Manawan）| 桑·西奥·康斯坦·洛特布洛·恩德鲁鲁（Sun Theo Constan Lotebulo Ndruru）| 迪基·安娜斯（Dicky Annas）| 贾洪·潘（Jia Hong Pan）| 梅加·萨菲特里（Mega Safithri）| I.马德·阿蒂卡（I.Made Artika）| 罗伯图斯·瓦休·N·努格罗霍（Robertus Wahyu N. Nugroho）
印度尼西亚西爪哇省茂物市农业学院（IPB）数学与自然科学系生物化学系，邮编16680
摘要
低温电子断层扫描（cryo-ET）能够在原位环境下对大分子复合物进行结构分析，其空间尺度覆盖了四个数量级以上：从通过相关成像技术获得的微米级细胞环境，到通过亚层析图平均（STA）技术实现的近亚纳米级分辨率。本文综述了在细胞结构映射方面的最新进展，包括膜结合的细胞器、细胞骨架网络、粘附复合体以及纤毛和核孔复合体（NPC）等离散的细胞亚系统。我们讨论了与细胞低温电子断层扫描相关的主要挑战，如样本厚度和电子透明度的限制、结构异质性、许多复合物的瞬态性质、目标定位的精确度受限、分子鉴定的不可靠性以及标记过程中的伪影。文章还回顾了为应对这些挑战而开发的最新策略，特别强调了样品制备方面的创新及其与低温聚焦离子束铣削（cryo-FIB）、低温相关光电子显微镜（cryo-CLEM）、STA以及补充的体积成像技术（如低温扫描透射电子断层扫描（cryo-STET）和低温软X射线断层扫描（cryo-SXT）的整合。此外，我们还介绍了在达到足够分辨率时用于分子解释的基于密度的建模方法，以及二维（2D）模板匹配技术。总体而言，这些发展为研究细胞在其原始环境中的超微结构提供了重要的工具。
引言
结构生物学的一个核心目标是揭示细胞在其天然状态下的分子结构。虽然光学显微镜能够动态追踪活体系统中的标记蛋白质，传统电子显微镜可以提供固定结构的高分辨率成像，但这两种方法都无法完全解析完整细胞内大分子复合物的天然排列。低温电子断层扫描（cryo-ET）通过实现玻璃化样本的三维成像，克服了这些限制，从而能够在无需化学固定或染色的情况下“原位”捕获大分子复合体，并将失真和制备引起的伪影降至最低。因此，cryo-ET极大地提升了我们在接近天然状态下观察亚细胞结构及其生理环境的能力。然而，cryo-ET本身也受到重建伪影的制约，尤其是由于严格的电子剂量限制导致的“缺失楔形效应”和低信噪比问题。
光学显微镜受到可见光波长的根本限制。相比之下，cryo-ET使用皮米级波长的透射电子显微镜（TEM），在特定情况下可以实现接近原子的分辨率（McCafferty等人，2024年）。重要的是，cryo-ET的样品制备过程通过快速玻璃化保持了细胞的天然状态——细胞内的水在几毫秒内转化为非晶态冰（McDonald和Auer，2006年；Wagner等人，2017年）。这一过程消除了化学固定或脱水的需要，从而在保护样本免受电子束损伤和高真空环境影响的同时，保持了大分子的天然排列（McCafferty等人，2024年）。然而，实际上，可靠的玻璃化通常仅适用于厚度小于约1微米的样本；声称能够对厚度接近10微米的整个细胞进行玻璃化的报道可能并不反映样本内部的均匀玻璃化状态（Mahamid等人，2016年；Weiner等人，2013年）。
cryo-ET在重塑我们对基本细胞过程的理解方面具有独特优势，包括信号转导、膜重塑和细胞-细胞外基质（ECM）的粘附机制。它与低温聚焦离子束扫描电子显微镜（cryo-FIB-SEM）和低温相关光电子显微镜（cryo-CLEM）等互补方法的结合，进一步增强了其对感兴趣区域的超微结构精准定位的能力（图1）。例如，cryo-FIB铣削技术可以从培养细胞中制备出薄层切片，从而以高分辨率访问原本无法触及的细胞内部区域（Berger等人，2023a）。这些互补方法主要改善了空间定位和上下文解释能力，而不是确保整个细胞体积内的分子分辨率均匀性。
cryo-ET工作流程的一个显著特点是它能够跨越四个数量级的空间尺度：从通过cryo-CLEM实现的微米级兴趣区域（ROI）定位，到通过亚层析图平均（STA）获得的亚纳米级分辨率。这种广泛的覆盖范围在每个尺度上引入了不同的解释框架和技术限制。虽然cryo-CLEM有助于在整个细胞中识别ROI，但高分辨率成像最终受到电子透明度的限制，而电子透明度又受到非弹性电子散射的影响。非弹性散射的电子会降低图像对比度并导致色差，从而实际上将可用样本厚度限制在大约300纳米左右（在典型加速电压下）。这一物理限制决定了为了实现高分辨率的STA，样本厚度通常需要在100-200纳米范围内。
在实际应用中，cryo-ET在如此广泛的空间尺度上的操作能力催生了两种部分重叠但概念上不同的应用方向：一种侧重于细胞超微结构的体积成像，旨在覆盖和解析细胞器、细胞骨架网络和膜相关复合物（例如Nedozralova等人，2022年）；另一种则将cryo-ET扩展到结构生物学领域，其中STA能够直接在细胞内实现大分子复合体的接近原子级分辨率分析（例如Ni等人，2022年）。在本综述中，我们主要关注细胞低温电子断层扫描及其在目标定位和亚细胞结构解释方面的挑战。因此，亚层析图平均和原位结构生物学被视为下游分析扩展，它们在ROI选择或分子解释中起着直接作用。
在cryo-ET在原位结构生物学中的更广泛应用中，仍有几个关键问题需要解决：
现有cryo-ET工作流程在样品制备和成像方面存在哪些限制，特别是针对细胞器（如核糖体、线粒体）、大型大分子复合物（如核孔复合体（NPCs）、膜突起（如纤毛）和粘附复合体等亚细胞目标？
最近在cryo-FIB铣削、cryo-CLEM定位和玻璃化协议方面的创新如何改善ROI的定位和可访问性，包括富含核糖体的细胞质、线粒体嵴、核膜和基于整合素的粘附位点？
哪些计算策略（如分割、STA和基于深度学习的方法）最适合分析同时包含丰富结构和空间受限且具有组成和结构异质性的cryo-ET数据集？
相对均匀的大分子复合物（如核糖体和NPCs）与结构变化较大或空间受限的目标（如粘附簇、细胞骨架连接点和纤毛）在成像和分析策略上有什么区别？
在cryo-ET工作流程的未来创新中，包括改进的玻璃化技术、层片定位和综合建模，如何解决与分辨率、通量和分子鉴定相关的持续挑战？
尽管之前的综述强调了cryo-ET在多细胞和组织尺度上的进展，但往往侧重于大体积成像而非分子解释（例如Caspy等人，2025年，主要关注厚样本成像）。本文则聚焦于在分子和超分子水平上定位和解析亚细胞ROI的具体挑战。我们首先探讨了代表性“原位”目标（如细胞器、细胞骨架结构和膜相关复合物）所带来的成像挑战，然后讨论了样品制备方面的最新进展，特别是cryo-FIB铣削和cryo-CLEM定位技术，以及cryo-ET和补充体积成像技术（如cryo-STEM、软X射线断层扫描和时序cryo-ET）的发展。最后，我们介绍了新兴的自动化策略和计算工具（如STA、深度学习和基于密度的建模），并指出了加速分子结构与细胞功能研究交叉领域发现的关键研究空白和未来方向。
作为细胞超微结构映射工具的cryo-ET
cryo-ET已成为一种强大的多功能工具，能够在接近天然状态的细胞环境中以纳米级分辨率映射亚细胞结构。其在细胞-细胞外基质（ECM）粘附复合体可视化方面的应用尤为显著，这些复合体作为动态枢纽，在机械上固定细胞的同时协调关键信号通路。除了粘附位点外，cryo-ET还实现了膜结合细胞器的详细结构分析。
cryo-ET的样品制备策略
高质量样品的制备是cryo-ET中最关键且技术要求最高的步骤之一。许多感兴趣的亚细胞结构（包括细胞器、膜接触点和粘附界面）在玻璃化、转移或cryo-FIB铣削过程中极易受到机械应力和变形的影响。位于基底膜附近的基于整合素的粘附复合体尤其脆弱，因为它们直接暴露在电子显微镜（EM）的照射下。亚细胞映射的结构工具
推进cryo-ET成像不仅需要优化的样品制备，还需要增强分辨率、定位准确性和相关性保真的补充结构工具。由于许多亚细胞目标体积小、异质性强或深埋在细胞内部，这些工具对于克服低温荧光显微镜的固有局限性以及实现可靠的ROI选择至关重要。
未来展望与结论
低温电子断层扫描（cryo-ET）已成为结构生物学中的一个变革性工具，其空间尺度跨越了四个数量级以上——从cryo-CLEM引导的微米级定位到通过亚层析图平均（STA）实现的亚纳米级分辨率。像核糖体或线粒体蛋白复合体这样的丰富且高度有序的复合物非常适合传统的快速冷冻和STA工作流程，可实现接近原子的分辨率。
CRediT作者贡献声明
贾洪·潘（Jia Hong Pan）：撰写、审稿与编辑、可视化、监督。
梅加·萨菲特里（Mega Safithri）：监督。
桑·西奥·康斯坦·洛特布洛·恩德鲁鲁（Sun Theo Constan Lotebulo Ndruru）：撰写、审稿与编辑、可视化。
迪基·安娜斯（Dicky Annas）：撰写、审稿与编辑。
I.马德·阿蒂卡（I Made Artika）：监督。
罗伯图斯·瓦休·N·努格罗霍（Robertus Wahyu N. Nugroho）：撰写、审稿与编辑、可视化、监督、项目管理、概念化。
克里斯托弗·欧亨尼奥·威利姆（Christopher Eugenio Williem）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、可视化、软件开发。
维拉尼塔萨·斯蒂芬妮（Viranitasya Stephanie）：
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文所述工作的利益冲突。
致谢
作者感谢印度尼西亚教育机构基金（LPDP）与国家研究与创新机构（BRIN）颁发的RIIM-结构生物学研究资助（资助编号B-4760/II.5/FR.06.00/9/2024）的支持。
