新型G-四链体探针与CRISPR/Cas12a结合，用于超灵敏且高度特异的核酸检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Novel G-quadruplex probe coupled with CRISPR/Cas12a for ultrasensitive and highly specific nucleic acid testing

CRISPR/Cas12a与新型淬灭-free荧光G4探针结合实现高效核酸检测，通过3'末尾序列调控G4稳定性增强切割效率，灵敏度达16 aM，与qPCR结果完全一致。

　　

黄江|吴文文|卢世月|徐源|张红|尚书|杨欣|何洪飞|王强|杨汉峰|罗光成

四川省北医学院附属医院临床实验室；四川省北医学院实验室医学与转化医学研究中心，中国南充637000

摘要

将CRISPR/Cas12a与成本效益高的探针结合对于分子诊断至关重要。然而，经典的荧光团-淬灭剂标记的单链DNA（ssDNA）探针具有较高的生产成本。在此，我们开发了一种新型的无淬灭剂荧光G四链体（G4）探针，具有出色的成本效益，适用于CRISPR/Cas12a。我们发现FAM荧光团可以被G4有效淬灭，而在单个FAM标记的G4中引入3′端侧翼序列会破坏其拓扑结构，从而使得CRISPR/Cas12a能够高效地进行切割并释放被G4淬灭的荧光。与传统关闭型CRISPR/Cas12a/G4系统相比，这种G4辅助的CRISPR/Cas12a报告系统（GCR）创新性地实现了成本效益高的开启型信号输出。此外，我们将GCR与先前开发的dNTPαS辅助的RPA技术整合，建立了RPA/GCR检测方法。该方法具有超灵敏度（高达16 aM）和单碱基分辨能力，HBV DNA检测结果与qPCR结果的一致性达到100%。总之，我们开发了一种新型的CRISPR/Cas12a/G4信号开启策略，并建立了一种实用的RPA/GCR检测方法，展示了其在分子诊断中的巨大潜力。

引言

分子诊断在传染病、遗传病和恶性肿瘤的检测中发挥着重要作用[1]、[2]、[3]。作为新兴的尖端分子诊断工具，CRISPR/Cas系统受到了广泛关注并得到了广泛应用[4]、[5]。对于核酸检测，CRISPR/Cas12a能够特异性识别目标DNA并高效地非特异性降解单链DNA（ssDNA），从而将目标DNA的识别转化为可检测的信号[5]、[6]、[7]。

基于这种切割机制，CRISPR/Cas12a通常使用FAM/BHQ双标记的ssDNA来实现开启型信号输出（ssDNA降解后释放被淬灭的荧光）[8]、[9]，或使用G4实现关闭型比色检测（G4降解后消除G4过氧化物酶活性和显色反应）[10]、[11]、[12]。然而，相对昂贵的FAM/BHQ双标记报告系统在储存过程中不稳定，导致淬灭效率降低[13]。G4是通过四方Hoogsteen氢键网络形成的G四链结构。将G4整合到CRISPR/Cas12a中是一种成本效益高的比色核酸检测方法[14]、[15]。然而，这些方法通常采用关闭型读出模式[16]、[17]。因此，迫切需要开发低成本、简单且可视化的CRISPR/Cas12a核酸检测报告系统。

研究表明，核酸碱基具有荧光淬灭效应，其中鸟嘌呤（G）的淬灭效率最高[18]、[19]。G4丰富的独特结构使我们推测它们能够有效淬灭荧光。然而，G4本身的核酸酶抗性对CRISPR/Cas12a介导的切割过程有显著影响，从而不利地影响了信号生成[20]、[21]、[22]。先前的研究显示，随着环状结构或侧翼序列长度的增加，G4的稳定性会降低[23]。基于这些发现，我们推测在G4中添加侧翼序列可以通过破坏其结构来提高CRISPR/Cas12a的切割效率。

在此，我们开发了一种新型的G4辅助的CRISPR/Cas12a报告系统（GCR），通过将CRISPR/Cas12a与3′端带侧翼序列的G4结合来实现信号输出。与传统关闭型CRISPR/Cas12a/G4系统[16]、[17]不同，我们的GCR创新性地实现了成本效益高的开启型信号输出。此外，利用先前开发的S-RPA（dNTPαS辅助的RPA）[24]，我们成功建立了RPA/GCR检测方法。该方法具有超灵敏度（高达16 aM）、高特异性（能够区分单碱基），并且与qPCR结果的一致性达到100%，展示了其在分子诊断中的巨大潜力。

材料与试剂

试剂包括DNA寡核苷酸、质粒、gRNA、dNTPs、SYBR Green、丙烯酰胺/甲基丙烯酰胺（29:1）、聚丙烯酰胺、丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、4SGelred核酸染料以及6×、2× DNA上样缓冲液，均购自上海Sangon Biotech（中国上海）。3'-FAM修饰的DNA寡核苷酸购自Hippo Biotechnology（中国浙江）。磷酸硫代酯修饰的dNTPs（dNTPαS）购自Zhong Meng Research Technology（湖北）。

Cas12a对带尾G4的高效切割

根据我们的假设（图1A），线性Poly G和G4能够有效淬灭荧光（图S1），但抵抗Cas12a的切割；而带有3′端侧翼序列的3′-尾G4既能淬灭荧光又能被Cas12a高效切割。实时分析证实，3′-尾G4（特别是G4_2-1）具有更高的Cas12a切割效率（图1B）和最显著的荧光差异（图1C），优于线性Poly G和常规G4。PAGE分析进一步验证了这一结果。

讨论

CRISPR/Cas12a与G4的结合是比色核酸检测中最常见的策略之一。然而，这种策略通常依赖于CRISPR/Cas12a介导的G4切割来产生关闭型信号[16]、[17]。研究表明鸟嘌呤（G）能够有效淬灭荧光[18]、[19]。因此，我们推测富含G的G4可以无需额外淬灭基团即可有效淬灭FAM荧光；Cas12a介导的G4切割过程可以进一步增强这种效果。

资助

本工作得到了以下资助：国家自然科学基金（82472386）、四川省自然科学基金（2024NSFSC1546）、四川省卫生健康委员会（23LCYJ038）、南充市科学技术基金（23JCYJPT0032）以及四川省北医学院附属医院研究基金（2024CX001和2023PTZK016）的支持。

CRediT作者贡献声明

杨欣：验证、方法学研究。尚书：研究工作、资金获取。张红：项目管理、资金获取。徐源：研究工作、资金获取。卢世月：数据可视化、验证。吴文文：研究工作、数据分析。黄江：初稿撰写、验证、数据管理。罗光成：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念设计。杨汉峰：监督、软件开发、资金获取。

利益冲突声明

无。

黄江于2025年获得四川省北医学院临床实验室诊断硕士学位。目前她在中国绵阳市安州区人民医院临床实验室担任技术员，主要从事新型分子探针和分子诊断技术的研发工作。