《Scientific Reports》：PERK/ATF4/LAMP3-arm contributes to the aggressive phenotype of hepatocellular carcinoma cells in response to the chronic ethanol exposure
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本研究针对酒精相关性肝细胞癌（A-HCC）分子机制不清的临床难题，发现慢性乙醇暴露可激活内质网应激（ERS）的PERK/ATF4通路，上调LAMP3、CHOP、VEGF-A等因子，促进NF-κB核转位，最终增强肝癌细胞侵袭、迁移、干性并抑制凋亡。使用PERK抑制剂GSK2606414可逆转上述表型，为A-HCC靶向治疗提供新策略。
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球范围内发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤，其发生发展与多种风险因素密切相关，其中长期大量饮酒是重要的诱因之一，由此导致的酒精相关性肝细胞癌（Alcohol-associated HCC, A-HCC）具有独特的临床和分子特征。尽管酒精对HCC的不良影响已被广泛认知，但与病毒性肝炎相关的HCC相比，人们对A-HCC的分子机制了解仍存在显著空白，这限制了针对A-HCC的有效治疗策略的开发。肿瘤细胞常常处于缺氧、氧化应激等不利环境中，会引发持续的内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）。内质网应激会激活一个关键的细胞自我保护机制——未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）。UPR主要通过三个跨膜传感器介导：肌醇需求酶1α（IRE-1α）、激活转录因子6（ATF-6）和蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）。在正常情况下，这些传感器与葡萄糖调节蛋白78（GRP78）结合而处于失活状态。当内质网中错误折叠蛋白堆积时，GRP78会解离，从而启动UPR信号转导。UPR的激活是一把双刃剑：适度的UPR有助于细胞适应应激环境而存活，但过度或持续的UPR则会诱导细胞凋亡。然而，在肿瘤背景下，尤其是在A-HCC中，肿瘤细胞如何利用UPR信号来逃避ERS诱导的凋亡，并在慢性乙醇暴露这种持续应激下获得更强的侵袭性，其具体机制尚不明确。为了解决这一科学问题，发表在《Scientific Reports》上的这项研究深入探讨了慢性乙醇暴露如何通过调节UPR，特别是PERK信号通路，来影响肝细胞癌的恶性进展。
为了开展研究，研究人员主要应用了细胞活力检测（MTT法）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot）、免疫荧光染色、细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验、肿瘤球形成实验、流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V/PI染色）和活性氧（ROS）检测等关键技术方法，并在HepG2、Hep3B和Huh-7三种人肝癌细胞系上进行了验证。
3.1 慢性乙醇暴露对细胞形态和细胞活力的影响
研究人员首先用不同浓度乙醇处理HepG2、Hep3B和Huh-7细胞5天，发现50mM、100mM和150mM乙醇处理下，细胞仍保持上皮样形态，但生长速率略有下降。200mM乙醇则导致细胞活力显著降低（低于50%），因此后续实验选用50mM、100mM和150mM这三个浓度。
3.2 慢性乙醇暴露条件下UPR通路不同基因的mRNA表达
通过RT-qPCR检测UPR通路相关基因的表达，发现在HepG2和Hep3B细胞中，ERS主调控因子GRP78的mRNA表达在较高浓度乙醇（100mM, 150mM）下显著上调。进一步分析UPR三条分支通路发现，PERK通路的关键组分，包括PERK本身、其下游效应分子ATF4、以及ATF4的靶基因LAMP3和CHOP，在HepG2和Hep3B细胞中均呈现浓度依赖性的显著上调。与此形成对比的是，IRE-1α-XBP1通路和ATF6通路的基因表达变化不明显或不规律，且未检测到XBP1的剪接产物（XBP1s）。此外，与脂质代谢相关的转录因子SREBP-1c和SREBP-2，促血管生成因子VEGF-A，以及促炎转录因子NF-κB的mRNA表达也显著增加，这与细胞内/外甘油三酯、胆固醇和乳酸脱氢酶（LDH）水平升高的结果相一致。然而，在Huh-7细胞中，这些基因的表达变化模式不一致，提示不同来源的肝癌细胞对乙醇的反应存在差异。基于HepG2和Hep3B细胞表现出更系统和显著的PERK通路激活，后续机制研究集中在这两种细胞系。
3.3 慢性乙醇暴露对UPR通路蛋白表达的影响
蛋白质水平的结果进一步验证了mRNA的发现。Western Blot结果显示，在HepG2细胞中，磷酸化PERK（p-PERK）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）、ATF4、CHOP和LAMP3的蛋白表达在150mM乙醇处理下均显著增加，而ATF6蛋白水平无显著变化。在Hep3B细胞中，ATF4和CHOP蛋白也显著上调，LAMP3有升高趋势，但p-PERK和p-eIF2α的变化不显著，提示可能存在细胞系特异性的调控。免疫荧光染色显示，在对照组HepG2和Hep3B细胞中，NF-κB主要定位于细胞质，而乙醇处理后，NF-κB发生了明显的核转位，表明其转录活性被激活。
3.4 GSK2606414（PERK抑制剂）处理对乙醇处理细胞中UPR的PERK-ATF4臂的影响
为了确认PERK通路的功能性作用，研究人员使用了PERK抑制剂GSK2606414。结果表明，在经150mM乙醇处理的HepG2和Hep3B细胞中，加入GSK2606414能够有效逆转乙醇引起的p-eIF2α、ATF4和LAMP3蛋白水平的升高，证实了PERK抑制剂的效用。
3.5 慢性乙醇暴露对ROS产生的影响
使用DCFH-DA染料检测活性氧（ROS）水平，发现150mM乙醇处理显著增加了HepG2和Hep3B细胞中ROS的生成，而使用PERK抑制剂GSK2606414则能显著降低这种乙醇诱导的ROS水平。
3.6 乙醇暴露和PERK抑制对不同癌症特征影响的测定
研究人员进一步评估了乙醇暴露和PERK抑制对肝癌细胞恶性生物学行为的影响：
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细胞侵袭：Transwell侵袭实验表明，乙醇处理显著增强了HepG2和Hep3B细胞的侵袭能力，而PERK抑制剂处理则能几乎完全阻断这种促侵袭效应。
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细胞迁移：划痕实验显示，乙醇处理加速了HepG2和Hep3B细胞的伤口闭合速度，即迁移能力增强，而PERK抑制剂处理则显著延缓了伤口愈合。
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癌症干细胞特性（干性）：肿瘤球形成实验发现，乙醇处理显著增加了HepG2和Hep3B细胞形成肿瘤球（代表具有干细胞特性的细胞）的数量，而使用PERK抑制剂后，乙醇处理组几乎无法形成肿瘤球，表明PERK通路对乙醇诱导的癌症干性至关重要。
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细胞凋亡：Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡显示，乙醇处理导致HepG2和Hep3B细胞的早期和晚期凋亡细胞比例显著下降，即产生了凋亡抵抗。而当使用PERK抑制剂后，乙醇处理组的凋亡细胞比例得以恢复，甚至有所增加。
本研究系统地阐明了在慢性乙醇暴露条件下，肝细胞癌通过激活UPR的PERK/ATF4信号轴获得侵袭性表型的分子机制。具体而言，乙醇应激激活PERK，导致eIF2α磷酸化，进而上调ATF4的表达。ATF4作为关键转录因子，驱动其下游靶基因如LAMP3、CHOP、VEGF-A等的表达，同时促进NF-κB的核转位和炎症反应，并通过调节SREBP-1c和SREBP-2影响脂质代谢。这一系列分子事件最终共同促进了肝癌细胞的侵袭、迁移、干细胞特性增强和凋亡抵抗。尤为重要的是，使用口服有效的PERK抑制剂GSK2606414能够有效逆转乙醇诱导的这些促癌表型。该研究不仅深化了对A-HCC发病机制的理解，揭示了PERK/ATF4/LAMP3通路在其中的核心作用，更重要的是为A-HCC的治疗提供了新的潜在靶点。研究表明，靶向抑制PERK信号通路有望成为一种有效的治疗策略，为改善A-HCC患者的不良预后带来了新的希望。当然，该研究的结论主要基于体外细胞模型，未来需要在更复杂的体内动物模型和临床样本中进行进一步验证，以推动其向临床应用的转化。
