《Scientific Reports》：Development and preliminary evaluation of real-time PCR assays for six lactic acid bacteria
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本研究针对食品工业中六种具有益生潜力的乳酸菌（Ligilactobacillus agilis、Limosilactobacillus fermentum、Lactobacillus johnsonii、Ligilactobacillus salivarius、Pediococcus pentosaceus和Weissella cibaria）缺乏快速精准鉴定方法的问题，开发了新型实时荧光定量PCR（qPCR）检测技术。研究人员通过生物信息学分析筛选物种特异性基因区域，设计引物与探针，并系统评估了方法的包容性、特异性、扩增效率（95%~100%）和精密度（RSD<2%）。结果表明，所建立的方法能够准确区分目标菌株，且稳定性良好，为益生菌产品的质量控制与行业应用提供了可靠工具。
在当今健康食品行业迅猛发展的背景下，益生菌作为“活的微生物”，其适量摄入可为宿主带来健康益处，已成为功能性食品研发的热点。乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）作为益生菌的重要成员，如Ligilactobacillus agilis、Limosilactobacillus fermentum、Lactobacillus johnsonii等，因其抗菌、抗炎、调节肠道菌群等特性备受关注。然而，传统依赖培养和生化反应的鉴定方法耗时耗力，且准确性有限，难以满足工业化生产中对菌株快速精准鉴定的需求。虽然基于16S rDNA的分子检测技术已有应用，但该区域存在单核苷酸多态性（SNP）和近缘种间序列高度相似的问题，可能导致特异性不足。因此，开发针对特定益生菌的高效、特异分子检测技术迫在眉睫。
为解决上述问题，研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新成果，致力于建立六种乳酸菌的特异性实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测方法。研究通过生物信息学分析筛选各菌株基因组中的保守且特异区域，设计引物和TaqMan探针，优化反应体系，并从包容性、特异性、扩增效率和精密度等方面进行了系统评价。结果显示，所有新开发的qPCR assays均表现出优异的性能，扩增效率接近100%，重复性与再现性良好（RSD<2%），为益生菌在食品工业中的质控应用提供了技术支撑。
关键技术方法包括：1）基于基因组数据库（如GenBank）进行引物/探针的in silico（计算机模拟）设计，严格遵循长度、Tm值、GC含量等参数规范；2）通过BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）分析靶序列的保守性与特异性；3）采用20μL反应体系，包含AceQ? qPCR Probe Master Mix、引物、探针及模板DNA，在LineGene 9600荧光定量PCR仪上运行40个循环；4）以16S rDNA测序鉴定的细菌DNA样本（由中国科学院动物科学研究所提供）为材料，进行方法学验证。
3.1 引物与探针的计算机模拟分析与设计
研究人员针对每种目标菌株，在其基因组保守区域设计了特异性引物和TaqMan探针。所有引物和探针的长度、Tm值、GC含量均符合设计指南（如探针长度13~30 nt，Tm 68~70°C）。通过分析二级结构（如发夹、自身二聚体）的吉布斯自由能（ΔG），发现多数参数符合推荐阈值，仅少数引物对存在轻微偏离（如L. salivarius反向引物发夹ΔG=-2.2 kcal/mol），但预计对PCR效率影响较小。BLAST比对证实靶序列在目标菌株内高度保守，且与近缘种差异显著，从理论上保障了方法的包容性与特异性。
3.2 包容性评价
使用5~16株目标菌株的DNA样本进行测试，所有样本均产生阳性扩增曲线（Ct<40），表明方法能有效检测不同菌株。结果提示新方法具有较低的假阴性风险，但受样本量限制，需进一步扩大验证。
3.3 特异性评价
以13种非目标肠道细菌DNA为对照，所有qPCR assays均未出现交叉反应，证明引物/探针序列具有高度特异性，可避免假阳性结果。
3.4 扩增效率评价
通过10倍梯度稀释模板DNA构建标准曲线，各 assays 的扩增效率为95.57%~99.37%，接近理想值100%，且Ct值差（3.34~3.43）与理论值（3.32）高度吻合，表明PCR反应高效稳定。
3.5 精密度评价
在两种模板浓度（Ct≈22和30）下，重复性（ intra-assay ）和再现性（ inter-assay ）的RSD均低于2%，远低于可接受阈值（25%），证明方法具有优异的重复性和可靠性。
本研究成功建立了六种乳酸菌的特异性qPCR检测方法，其引物/探针设计合理，反应体系稳定，在初步验证中展现出高包容性、特异性、扩增效率及精密度。这些方法为益生菌在食品工业中的快速鉴定、质量监控及产品开发提供了有力工具，尤其适用于替代传统耗时的培养法。未来需通过更多样本和仪器平台进一步验证其适用性，以推动益生菌资源的标准化应用。
