《Talanta Open》：Rapid RP-HPLC Method for Simultaneous Quantification of Fenoterol Hydrobromide and Ipratropium Bromide in Breathable and Respirable Fraction from Nebulizers
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本研究针对芬托溴铵(FEN)与异丙托溴铵(IPR)组合雾化吸入剂，开发了一种快速、灵敏的反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法，结合新一代撞击器(NGI)同步定量分析其可呼吸分数(breathable fraction)和可吸入分数(respirable fraction)。该方法成功应用于评估药物的空气动力学粒径分布(APSD)，结果显示FEN和IPR的平均可吸入质量(≤5μm)分别为226.596 μg和112.357 μg，平均可呼吸分数分别为294.901 μg和146.472 μg。该方法具有高灵敏度、短运行时间和成本效益，为吸入制剂的质量控制和法规符合性提供了可靠工具。
在呼吸系统疾病，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘的治疗领域，吸入给药因其能将药物直接递送至肺部、提高局部药物浓度、增强疗效并减少全身性不良反应，而成为优于口服或静脉给药的重要途径。雾化吸入，作为最古老的肺部给药方式之一，通过射流或超声雾化器将药物溶液转化为气溶胶，尤其适用于儿童、老年人以及吸气流量不足、协调性差的患者。芬托溴铵(Fenoterol hydrobromide, FEN)是一种吸入性β2肾上腺素受体激动剂，而异丙托溴铵(Ipratropium bromide, IPR)是一种抗胆碱能支气管扩张剂，两者联合使用对于管理和控制哮喘与COPD的症状具有独特优势。然而，吸入制剂的有效性极大程度上取决于其气溶胶颗粒能否有效沉积在目标呼吸道区域。空气动力学粒径分布(Aerodynamic Particle Size Distribution, APSD)是评估吸入制剂性能的关键指标，它模拟了药物吸入后在不同呼吸道区域的沉积情况。理想的气溶胶颗粒空气动力学直径应在1至5微米(μm)之间，粒径过大(>5μm)的颗粒易沉积于上呼吸道，而过小(<0.5μm)的颗粒则可能因布朗运动被呼出，无法有效沉积。因此，精确量化雾化剂的可呼吸分数(指适合人体吸入的气溶胶颗粒部分)和可呼吸分数(指粒径≤5μm、能深入肺部的细颗粒部分，等同于细颗粒剂量Fine Particle Dose, FPD)至关重要。尽管FEN和IPR的联合疗法已有临床研究，但针对其雾化吸入剂的空气动力学特性，尤其是APSD的研究相对缺乏，已有的高效液相色谱(HPLC)分析方法或在灵敏度方面不足，或分析时间较长，限制了其在低剂量检测和常规质量控制中的应用。为了解决上述问题，满足药品监管机构(如美国药典USP <601>和欧洲药品管理局EMA吸入制剂指南)对雾化产品空气动力学性能的严格要求，研究人员开展了一项旨在建立一种快速、灵敏、可靠的RP-HPLC方法，并结合新一代撞击器(Next Generation Impactor, NGI)来同步定量分析FEN和IPR雾化吸入剂的可呼吸分数和可吸入分数的研究。该研究论文已发表于《Talanta Open》期刊。
为开展本研究，研究人员主要应用了几个关键技术方法。首先是分析方法开发与验证：建立了基于X-Bridge C18色谱柱的等度洗脱RP-HPLC方法，优化了流动相（80:20 v/v的庚烷-1-磺酸钠盐溶液与乙腈）和色谱条件（柱温40°C，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm），并对方法的系统适用性、专属性、检测限(LOD)、定量限(LOQ)、线性、精密度、准确度（通过表面回收率评估）、稳健性和溶液稳定性进行了全面验证，确保方法符合ICH（国际人用药品注册技术协调会）指南要求。其次是空气动力学特性评估：使用新一代撞击器(NGI)在15 L/min的恒定流速下收集雾化后产生的气溶胶颗粒。NGI各阶段的截留粒径被精确设定，以模拟颗粒在呼吸道的沉积。通过专业软件（Copley inhaler testing data analysis software, CITDAS）计算了关键空气动力学参数，包括细颗粒剂量(FPD, 即可吸入分数)、细颗粒分数(Fine Particle Fraction, FPF)、中位质量空气动力学直径(Median Mass Aerodynamic Diameter, MMAD)、几何标准偏差(Geometric Standard Deviation, GSD)和质量平衡(Mass Balance, M.B.)。所有实验均进行了三次重复以确保结果的可重复性。
3. 结果与讨论
3.1. 系统适用性
开发的分析方法表现出优异的系统适用性。FEN和IPR的保留时间分别为2.22分钟和5.92分钟，分离度达到15.0。两者的峰形对称，拖尾因子分别为1.15和1.02，理论塔板数远高于可接受标准（≥2000）。连续六次进样的峰面积相对标准偏差(RSD)均小于2.0%，表明方法精密度高，运行时间短，适用于常规分析。
3.2. 专属性
方法专属性强，空白辅料（空白对照）和稀释剂在FEN和IPR的出峰时间处均无干扰峰。通过峰纯度分析进一步证实了目标峰纯度，表明在制剂辅料存在下无共洗脱现象。
3.3. 检测限与定量限
方法灵敏度高，FEN和IPR的检测限(LOD)分别为0.1501 μg/mL和0.0560 μg/mL（信噪比S/N>3），定量限(LOQ)分别为0.5005 μg/mL和0.1868 μg/mL（S/N>10），显著优于文献报道的方法，能够满足低剂量药物的准确定量需求。
3.4. 线性
在考察的浓度范围内，FEN（0.5005 - 18.7685 μg/mL）和IPR（0.1868 - 9.3388 μg/mL）的峰面积与浓度均呈现良好的线性关系，决定系数(R2)均大于0.999，表明方法在该范围内线性关系良好。
3.5. 精密度
方法精密度考察结果显示，六份独立制备的样品溶液中FEN和IPR含量的RSD均小于0.2%。在不同日期进行的中间精密度试验结果与方法精密度结果高度一致，累积平均值和RSD均在可接受范围内，证明了方法具有优异的重复性和再现性。
3.6. 准确度（表面回收率）
通过加样回收率试验评估方法的准确度。在LOQ、50%、100%、150%四个浓度水平下，FEN和IPR的平均回收率分别为101.0%和99.9%，所有回收率结果均在可接受标准内，表明方法准确可靠。
3.7. 稳健性
通过故意微小改变色谱条件（流速±0.1 mL/min，柱温±5°C，有机相比例±2%）进行稳健性考察。结果表明，这些参数的微小变化对FEN和IPR的含量测定结果均无显著影响，含量测定值的RSD均小于0.2%，证明所建立的方法稳健性强，对操作条件的变化不敏感。
3.8. 溶液稳定性
标准品溶液和样品溶液在室温下放置72小时内稳定性良好，测定结果无显著变化，确保了分析过程的可靠性。
3.9. 通过新一代撞击器评估可呼吸和可吸入分数
应用验证后的RP-HPLC方法分析NGI各阶段收集的药物沉积量，获得了FEN和IPR的阶段沉积分布 profile。数据显示，大部分可吸入颗粒沉积在NGI的Stage 3至Stage 7（对应截留粒径约5.39 μm至0.98 μm）。计算得到的空气动力学关键参数表明：FEN和IPR的平均可吸入分数（FPD，粒径≤5μm）分别为226.596 μg和112.357 μg，平均可呼吸分数分别为294.901 μg和146.472 μg。两者的细颗粒分数(FPF)均约为76.7%-76.8%，表明大部分雾化颗粒能有效沉积于肺部深处。MMAD值（FEN: 2.205 μm, IPR: 2.201 μm）落在理想的1-5 μm范围内，GSD值（约2.39）表明颗粒分布适中，有利于药物在气道区域的广泛而快速沉积。质量平衡结果接近100%，表明药物回收完全，实验过程可靠。
4. 结论与意义
本研究成功开发并验证了一种快速、灵敏、精确且稳健的RP-HPLC方法，用于同步测定雾化吸入液中芬托溴铵和异丙托溴铵的含量。该方法在灵敏度（更低的LOD和LOQ）和分析效率（更短的保留时间和运行时间）上均优于既往报道的方法。更重要的是，本研究将该分析方法与新一代撞击器(NGI)相结合，首次系统地表征了FEN和IPR复方雾化吸入剂的空气动力学性能，精确量化了其可呼吸分数和可吸入分数。研究结果显示，该雾化剂能产生高比例的、空气动力学直径在理想范围内的细颗粒，预示着其具有良好的肺部沉积潜力和临床疗效前景。该方法的高通量、低成本特性使其非常适用于制药工业中对吸入制剂进行的常规质量控制和法规符合性研究，例如递送剂量均一性和单剂量含量测定。此外，该方法为未来进行仿制药与原研药之间的体外-体内相关性研究提供了可靠的分析工具。未来的研究工作可探索将此方法拓展应用于其他超低剂量吸入药物的分析，并进一步评估其在更广泛吸入药物质量控制中的适用性，以巩固其工业与临床价值。
5. 资助与作者贡献
本研究未接受任何机构资助。第一作者Chirag Chilka负责了方法建立、软件验证、数据分析及论文初稿撰写；通讯作者Jayesh Dhalani负责研究指导、项目管理和论文审阅。
