《Talanta》：A broadly reactive monoclonal antibody-based immunochromatographic test kit for pan-detection of
Salmonella in foods
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沙门氏菌检测快速检测试纸开发及性能验证，采用单克隆抗体102B2靶向脂多糖内核心区，建立侧流免疫层析法，灵敏度0.1 μg/mL，特异性100%，检测范围10^5-10^8 CFU/mL，储存稳定性达60天，适用于资源有限地区食品筛查。
皮西妮·艾乌穆拉伊（Pisinee Aiumurai）、西里詹·桑塔吉特（Sirijan Santajit）、纳万纳蓬·萨埃-林（Nawannaporn Sae-lim）、塔帕尼·斯里斯赛（Thapani Srisai）、拉利塔·普托瓦埃德（Lalita Phuthowaed）、马纳斯·崇萨-关（Manas Chongsa-nguan）、蒂达·孔-恩（Thida Kong-Ngoen）、威塔瓦特·图尼永（Witawat Tunyong）、瓦特·塞苏艾（Watee Seesuay）、万彭·恰伊昆帕（Wanpen Chaicumpa）、尼塔亚·因德拉瓦塔纳（Nitaya Indrawattana）
泰国曼谷玛希隆大学（Mahidol University）西里拉杰医院（Siriraj Hospital）医学系研究部，西里拉杰过敏与免疫学研究中心（Siriraj Center of Research Excellence in Allergy and Immunology），邮编10700
摘要
由多种血清型的沙门氏菌（Salmonella enterica）引起的食源性疾病是全球性的公共卫生问题。为了确保食品安全，需要一种可靠、检测速度快且易于操作的检测方法。本研究报道了一种基于广谱反应性单克隆抗体的侧向流动免疫层析测试（ICT），用于快速检测食品中的沙门氏菌。该检测方法使用针对沙门氏菌脂多糖保守区域的单克隆抗体（克隆102B2）作为检测线上的捕获抗体，并使用胶体金标记的多克隆抗体作为检测探针。ICT试纸可在10分钟内提供可视化的结果，其对沙门氏菌全细胞匀浆的检测限为0.1 μg/mL，且与单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）无交叉反应。该检测方法的灵敏度范围为0.1–500 μg/mL的沙门氏菌全细胞匀浆，经ISO标准预富集后相当于约105–108 CFU/mL。多种沙门氏菌血清型（包括肠炎沙门氏菌（Enteritidis）、伤寒沙门氏菌（Typhi）和普纳沙门氏菌（Poona）均被成功检测到，且具有较高的特异性。在标准（2–8 °C和25–30 °C）和加速（40 °C）储存条件下的稳定性测试显示，其性能分别可保持14天和60天。这些结果表明，ICT作为一种快速筛查食品中沙门氏菌污染的工具具有可靠性和适用性，特别是在资源有限或现场环境中。
引言
沙门氏菌（Salmonella enterica）是一种主要的食源性病原体，可引发多种人类疾病，称为沙门氏菌病。这种疾病的严重程度从自限性的胃肠炎到严重的系统感染不等，包括伤寒和败血症，尤其是当感染扩散到血液或其他器官时。目前已鉴定出超过2,600种沙门氏菌血清型，每种血清型的毒力和对公共卫生的影响各不相同[1]。人类感染通常是通过摄入未充分煮熟、处理不当或加工不当的受污染食品而发生的，例如禽肉、鸡蛋、肉类、牛奶和乳制品[2, 3]。准确及时地检测食品中的沙门氏菌对于确保食品安全和预防病例及疫情爆发至关重要。传统的沙门氏菌检测、计数和分型方法依赖于培养技术，具体标准为EN ISO 6579-1:2017。尽管这种方法具有高度特异性，但耗时且劳动强度大，可能无法有效检测到在富集培养基中无法复苏的亚致死损伤细胞[4, 5]。基于PCR的技术等分子方法具有更高的灵敏度和更快的检测时间，尤其是在同时检测多个样本时。然而，这些方法存在无法区分活菌和死菌的局限性，在复杂食品基质中存在抑制物质时可能导致假阴性结果[6, 7]，并且在实验室或现场样本处理过程中可能因交叉污染而产生假阳性结果[8]。此外，背景微生物群（如与沙门氏菌有密切进化关系的柠檬酸杆菌属（Citrobacter）或变形杆菌属（Proteus））以及PCR本身的局限性也会进一步影响检测的准确性[8]。
脂多糖（LPS）是一种复杂的糖脂，是革兰氏阴性细菌（如沙门氏菌）外膜的主要结构成分，它作为屏障抵御宿主防御机制和抗生素的作用。LPS是一种细菌内毒素，能诱导人体产生全身性炎症反应，可能导致中毒性休克。每个LPS分子由最外层的O-抗原（O-特异性侧链）和核心多糖组成，O-抗原是由重复的糖单元组成的高度可变聚合物，从细胞表面向外延伸；核心多糖将O-抗原与高度保守的、靠近膜的疏水性脂质A连接起来。与其他肠杆菌科成员类似，沙门氏菌的O-抗原有助于免疫逃逸——掩盖LPS的保守区域，使其免受宿主适应性免疫反应的识别——并影响血清群或血清型的毒力[9, 10]。核心多糖分为外层和内层区域；外层寡糖的结构在不同沙门氏菌血清型之间存在差异，在上皮细胞侵袭中起关键作用[11]，而靠近脂质A的内层核心区域在该属内高度保守，对细菌外膜的稳定性和正常功能至关重要[12]。
小鼠杂交瘤克隆102B2分泌一种针对沙门氏菌LPS保守内层区域的单克隆抗体（mAb），能与所有测试的沙门氏菌菌株的LPS发生反应，但不会与其他细菌的抗原发生反应[13, 14]。基于mAb 102B2的简单点ELISA方法被开发出来，用于高效检测多种富集食品样本中的沙门氏菌（以检测活菌），但该检测方法需要多个孵育步骤，灵敏度中等[14, 15]。侧向流动免疫层析测试（ICT）提供了一种快速、经济且用户友好的替代方法。这些检测方法依赖于硝化纤维素膜上的抗原-抗体相互作用，可在几分钟内产生结果。由于其仪器要求低且适用于多种病原体，ICT试剂盒在野外诊断中得到广泛应用[16, 17]。本研究报道了一种基于广谱反应性102B2 mAb的侧向流动ICT，用于快速全面检测食品样本中的沙门氏菌。在标准和加速储存条件下对其性能和稳定性进行了评估，证明了其作为食品安全监测工具的可靠性。
实验部分
细菌抗原的制备
共使用了32株沙门氏菌菌株和27株非沙门氏菌（异源）细菌菌株（表1）进行抗原制备。所有细菌菌株最初都保存在甘油储备液中。每株菌株通过接种5 mL Luria–Bertani（LB）培养基并在37 °C下以200 rpm的速度振荡培养12-18小时进行传代培养。培养物在3,500 × g下离心20分钟后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，然后进行后续处理
mAb102B2的特异性
使用点印迹ELISA方法评估了mAb102B2对沙门氏菌全细胞匀浆及无关细菌菌株的特异性。如图2所示，该抗体与所有测试的沙门氏菌菌株的匀浆均表现出强烈的反应性（图2A），而与非沙门氏菌细菌无交叉反应（图2B），证实了mAb102B2对沙门氏菌抗原的高特异性。无交叉反应以及信号强度的一致性和强度
讨论
本研究开发的免疫层析测试（ICT）试纸提供了一种快速、易于使用且高度特异的沙门氏菌检测方法。在测试条件下，ICT的结果与传统的培养方法和实时PCR方法完全一致，表明其诊断准确性优异。这些发现与先前的研究结果一致，强调了ICT在检测食品中沙门氏菌方面的高灵敏度和特异性[7, 29]。虽然基于培养的方法
结论
本研究开发了一种基于广谱反应性单克隆抗体的免疫层析测试（ICT）试纸，用于快速检测各种食品样本中的沙门氏菌。该检测方法表现出优异的诊断准确性，与传统培养方法和实时PCR方法相比具有100%的灵敏度和特异性。其能够检测多种沙门氏菌血清型，且无与非目标生物的交叉反应，进一步证明了其有效性
CRediT作者贡献声明
蒂达·孔-恩（Thida Kong-Ngoen）：研究、数据分析。
马纳斯·崇萨-关（Manas Chongsa-nguan）：验证。
拉利塔·普托瓦埃德（Lalita Phuthowaed）：研究、数据分析。
塔帕尼·斯里斯赛（Thapani Srisai）：资金获取、数据分析。
尼塔亚·因德拉瓦塔纳（Nitaya Indrawattana）：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学研究、资金获取、数据分析、概念构思。
万彭·恰伊昆帕（Wanpen Chaicumpa）：未引用参考文献
38.; 39..
伦理批准
本文不包含任何作者参与的人类或动物研究。
利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
资金声明
本研究得到了泰国农业研究与发展局（Agricultural Research and Development Agency）的支持（授权号CRP5605021810）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
