《Synthetic and Systems Biotechnology》：A novel LPS-dependent outer membrane-anchoring mechanism for T9SS substrates enables engineered enzyme display and whole-cell PET degradation in
Cytophaga hutchinsonii
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本研究针对革兰氏阴性菌表面展示系统效率低下的难题，揭示了Cytophaga hutchinsonii中T9SS底物通过LPS依赖性机制锚定于外膜的新途径。研究人员通过构建CTD融合蛋白证实该修饰的普适性，并利用waaL基因敲除实验证明LPS合成关键酶对蛋白锚定的必要性。基于此机制成功开发了新型表面展示平台，实现了PET水解酶的功能性展示和PET降解。该研究为合成生物学提供了可编程的革兰氏阴性菌表面展示新工具。
在合成生物学领域，将功能酶展示于微生物细胞表面是开发生物催化剂的重要策略。然而，革兰氏阴性菌的传统表面展示系统存在明显局限：基于外膜蛋白（如Lpp-OmpA融合）或自转运蛋白的系统可能影响膜完整性，且异源蛋白分泌效率低。虽然冰核蛋白（INP）等先进载体能改善大蛋白展示效果，但仍依赖异源锚定蛋白的表达和膜插入，可能限制展示密度和催化效率。
针对这些挑战，山东大学微生物技术国家重点实验室的研究团队将目光投向天然具有高效蛋白分泌能力的纤维素降解菌Cytophaga hutchinsonii。该菌拥有特殊的IX型分泌系统（T9SS），能转运大量C末端结构域（CTD）标记的底物蛋白至细胞表面。然而，这些蛋白如何稳定锚定于外膜的机制尚不明确，阻碍了其工程化应用。该研究发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》，揭示了新型LPS依赖性锚定机制，并成功构建了高效的表面展示平台。
研究采用的关键技术包括：基因敲除与回补（构建waaL突变株）、蛋白质印迹（检测蛋白修饰与定位）、液相色谱-质谱联用（分析外膜蛋白质组）、酶谱法（检测纤维素酶活性）以及扫描电子显微镜（观察PET膜降解形貌）。
研究团队首先通过插入Twin-Strep标签研究内源T9SS底物CHU_2708，发现外膜组分中出现阶梯状修饰条带，而周质组分中无此现象，表明修饰发生于翻译后阶段。为验证CTD的通用性，他们将麦芽糖结合蛋白（MBP）与不同纤维素酶（Cel9A、Cel9B、Cel78）的CTD融合，证实阶梯状修饰严格依赖CTD。
通过生物信息学分析和基因敲除，团队鉴定出LPS合成关键酶WaaL（CHU_0602）。ΔwaaL突变株的LPS缺乏O抗原重复单元，且MBP-CTD融合蛋白的阶梯状修饰消失，证明T9SS底物锚定依赖完整LPS。蛋白质组学分析显示，52种A型CTD底物在野生型外膜中被检测到，而突变株中仅存17种；酶谱法进一步证实纤维素酶在突变株中从外膜转移至胞外。
功能上，LPS锚定显著增强酶稳定性：野生型外膜纤维素酶在50μg/mL胰蛋白酶处理下活性不变，而突变株分泌的酶活性降至58%。ΔwaaL突变株还表现出纤维素降解能力丧失、运动性缺陷以及对SDS、结晶紫等胁迫因子敏感性增加。
基于此机制，研究团队开发了新型表面展示平台。将PET水解酶（PETase）与Cel9A的CTD融合后，成功锚定于外膜，并检测到对苯二甲酸（TPA）和单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（MHET）等PET降解产物。扫描电镜显示表达PETase-CTD的工程菌可使PET薄膜表面产生明显腐蚀。绿色荧光蛋白（GFP）的展示成功进一步证明该系统对胞质易折叠蛋白的兼容性。
该研究首次阐明C. hutchinsonii通过LPS介导的新颖机制锚定T9SS底物，突破传统蛋白锚定策略的局限。所构建的LPS-CTD平台不依赖异源锚定蛋白，利用短肽标签（CTD）和宿主天然分泌系统实现高效展示，为降解塑料等环境污染物提供了新工具，极大拓展了合成生物学在革兰氏阴性菌工程化中的应用前景。
