《Synthetic and Systems Biotechnology》：Sustainable production of glutaric acid in microbial cell factories: Current advances and future prospects
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本综述系统梳理了微生物合成戊二酸（GA）的最新研究进展，重点聚焦于生物合成路径设计（如赖氨酸分解代谢的AMV和尸胺路径、α-酮戊二酸还原路径等）、代谢工程策略（包括常规代谢工程与系统代谢工程）及高效工程菌株的构建。文章深入探讨了系统生物学技术在戊二酸生物合成路径开发中的应用，并展望了人工智能辅助设计、动态调控、蛋白质工程及基于非粮底物的可持续生产等未来发展方向，为戊二酸及相关精细化学品的绿色生物制造提供了重要的理论与技术指导。
引言
戊二酸作为一种重要的C5二元羧酸，在化工、医药及生物材料领域具有广泛应用。随着合成生物学与代谢工程的发展，利用微生物细胞工厂生产戊二酸已成为替代传统化学合成法的可持续方案。微生物细胞工厂通过系统代谢网络设计与定向改造，实现目标产物生物合成路径的精准调控，从而高效合成高附加值化学品。面对全球气候变化与化石资源枯竭，利用可再生原料构建高效微生物细胞工厂已成为替代传统石化生产的关键策略。
戊二酸生物合成的天然与人工路径
目前，戊二酸可通过四种代谢路径进行生物合成：赖氨酸分解代谢、α-酮戊二酸（α-KG）还原、α-KG碳链延伸与脱羧以及反向β-氧化。其中，赖氨酸分解代谢路径包括天然存在于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的5-氨基戊酸（AMV）路径和在大肠杆菌（Escherichia coli）中通过尸胺路径的转化方式。AMV路径涉及四种酶促反应：赖氨酸2-单加氧酶（DavB）、δ-氨基戊酰胺水解酶（DavA）、5-氨基戊酸转氨酶（DavT）和戊二酸半醛脱氢酶（DavD）。而尸胺路径则包括赖氨酸脱羧酶（CadA/LdcC）、尸胺转氨酶（PatA）、氨基戊醛脱氢酶（PatD）等酶促步骤。尽管尸胺路径比AMV路径多一步反应，但其厌氧代谢特性在工业发酵中具有独特优势。
α-酮戊二酸还原路径通过在重组大肠杆菌中异源表达2-羟基戊二酸脱氢酶（hgdH）、戊烯二酸CoA转移酶（gctAB）、2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶（hgdAB）及其激活蛋白hgdC、反式烯酰辅酶A还原酶突变体（terI287V）和硫酯酶（tesB），实现从α-KG到戊二酸的多步酶促转化。α-KG碳链延伸-脱羧路径则通过引入酵母菌的同型柠檬酸合酶（HCS）、同型乌头酸酶（HA）和同型异柠檬酸脱氢酶（DHDH）实现α-KG的“+1”延伸，生成α-酮己二酸，再通过α-酮酸脱羧酶（KivD）和琥珀酸半醛脱氢酶（GabD）转化为戊二酸。反向β-氧化路径利用来自灰色双歧杆菌（Bifidobacterium griseus）的六种关键酶，以丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A为前体合成戊二酸，且不产生二氧化碳。
代谢通量分析表明，赖氨酸分解代谢路径的理论摩尔产量最高，可达0.75 mol/mol葡萄糖，显著高于α-酮戊二酸路径的0.67 mol/mol葡萄糖。通过代谢工程优化，实验室规模的赖氨酸衍生戊二酸合成产量已超过100 g/L，显示出巨大的商业化潜力。
戊二酸生物合成菌株的代谢工程策略
常规代谢工程
常规代谢工程通过过表达关键酶基因、敲除竞争路径、优化启动子/调控元件等策略构建戊二酸生产菌株。在恶臭假单胞菌中，通过敲除戊二酰辅酶A脱氢酶（gdh）和Fe2+/2-酮戊二酸依赖性戊二酸羟化酶（cisD）阻断戊二酸分解路径，并删除丙氨酸消旋酶基因（alr）抑制前体L-赖氨酸转化，工程菌株在含葡萄糖和L-赖氨酸的培养基中产生1.94 g/L戊二酸。但由于恶臭假单胞菌发酵过程对溶氧和pH控制要求高，且耗氧量大，增加大规模生产成本，研究者多选择遗传背景清晰、生长快、易放大的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌作为宿主。
在大肠杆菌中，Park等异源表达恶臭假单胞菌的davAB和gabTD基因簇，重组菌WL3110在含葡萄糖、L-赖氨酸和α-KG的培养基中产生1.7 g/L戊二酸。Adkins等通过引入天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的反馈抗性突变体，并敲除内源赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldcC，限制副产物尸胺积累，提高L-赖氨酸供应，但工程菌戊二酸产量仅0.82 g/L，表明α-KG供应不足限制转化效率。为规避α-KG添加，Wang等设计α-KG碳链延伸路径，通过CRISPRi抑制TCA循环中的sucA和sucB增加α-KG通量，最终菌株戊二酸产量0.42 g/L。Zhao等将源自梭形双歧杆菌的五步反向β-氧化路径引入大肠杆菌，通过优化培养基、诱导剂、抑制剂及敲除竞争路径关键酶基因，在补料发酵中使工程菌Bgl4146的戊二酸浓度在80小时内达到36.5 mM。
谷氨酸棒杆菌作为工业L-赖氨酸生产菌，是戊二酸合成的理想宿主。通过引入恶臭假单胞菌的davTDBA基因簇，可在谷氨酸棒杆菌中构建戊二酸合成路径。表达密码子优化的davTDA和His标签davB的工程菌H30_GAHis在补料发酵中产生24.5 g/L戊二酸。Pérez-García等通过引入大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶、腐胺转氨酶和γ-氨基丁醛脱氢酶，以及谷氨酸棒杆菌或恶臭假单胞菌的GABA/5AVA转氨酶和琥珀酸/戊二酸半醛脱氢酶，构建工程菌，通过敲除副产物积累相关基因，将戊二酸过量生产与L-谷氨酸生物合成耦合，最终菌株在补料发酵中戊二酸浓度达25 g/L。Sohn等基于双载体系统构建L-赖氨酸转化模块和戊二酸生产模块，将L-赖氨酸合成路径中的NADPH依赖酶替换为NADH依赖酶，并优化davB和davA表达水平，工程菌在5 L补料发酵中产生65.6 g/L戊二酸。
系统代谢工程
系统代谢工程整合多组学分析工具，实现代谢网络全局优化。Li等在大肠杆菌中基于天然赖氨酸分解机制设计多模块协同调控策略，包括增强赖氨酸合成、缓解反馈抑制、优化草酰乙酸供应，并通过过表达特定转运蛋白减少中间代谢物外排，工程菌BM31PER在补料发酵中戊二酸产量54.5 g/L，摩尔得率0.54 mol/mol葡萄糖。Chu等构建无质粒重组大肠杆菌，通过ARTP诱变结合赖氨酸生物传感器高通量筛选获得L-赖氨酸生产菌LYS-14，利用戊二酸生物传感器优化关键酶基因拷贝数，并通过转录组分析鉴定戊二酸转运蛋白YidE，过表达后戊二酸产量、得率和生产率分别提高38%、37.9%和7.1%，5 L补料发酵中戊二酸产量44.8 g/L。Wang等通过体外路径重构系统优化尸胺路径，利用核糖体结合位点（RBS）调控关键酶EcCA、KpcPA、KpcPD摩尔比例，并通过理性设计提升KpcPA催化活性，过表达5-氨基戊酸转运蛋白GabP减少中间产物积累，工程菌Glu-02以100 g/L L-赖氨酸为底物在42小时内产生77.62 g/L戊二酸，碳摩尔转化率0.78 g/g，创大肠杆菌戊二酸产量新纪录。
在谷氨酸棒杆菌中，Rohles等以5-AVA生产菌AVA-2为出发菌株，过表达组成型启动子Ptuf驱动的5-氨基戊酸转氨酶（GabT）和戊二酸半醛脱氢酶（GabD），将5-AVA转化为戊二酸，并过表达5-AVA转运蛋白NCgl0464减少中间产物积累，工程菌GTA-4在补料发酵中从葡萄糖和糖蜜生产90 g/L戊二酸，得率0.70 mol/mol葡萄糖，最大生产率1.8 g/L/h。Han等通过对L-赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌BE进行系统代谢改造，引入恶臭假单胞菌的davBA和谷氨酸棒杆菌的gabTD，基于基因组尺度代谢模型分析、比较转录组分析和通量响应分析精准调控11个靶基因表达水平，并首次鉴定戊二酸转运蛋白编码基因ynfM，工程菌GA17（pGA4）在补料发酵中戊二酸产量达105.3 g/L，得率和生产率分别为0.54 g/g和1.53 g/L·h?1，显著高于亲本菌。
总体而言，代謝工程可快速构建戊二酸生产菌，但后期产量提升易遇瓶颈；系统代谢工程能精准突破瓶颈，显著提升菌株性能。转运蛋白工程通过过表达产物转运蛋白或敲除中间代谢物输出蛋白，可有效解决产物外排效率低和中间代谢物流失问题。谷氨酸棒杆菌凭借其优越的L-赖氨酸生产能力和稳健的工业发酵特性，在戊二酸生物合成中优势明显。
未来展望与挑战
基于组学分析的反向代谢工程
反向代谢工程通过抑制或减少竞争路径、副产物合成或有毒代谢物积累，增强目标产物合成。多组学技术可全面解析微生物代谢调控机制，精准识别代谢路径关键修饰靶点。然而，组学数据在测量方法、时间尺度和动态范围上存在差异，静态数据难以反映细胞真实动态代谢状态。人工智能驱动数据融合、实时代谢组学与微流控芯片整合、多尺度代谢模型等先进技术有望助力构建更精准的细胞代谢工程框架。
基于动态调控的通量平衡
动态调控使细胞能实时响应环境信号或内部代谢变化，调整基因表达或代谢路径活性，平衡生长与产物合成，提升目标代谢物产量和细胞适应性。基于群体感应效应的遗传电路可将基因表达与细胞生理状态整合，用于平衡细胞生长与产物合成碳通量。戊二酸生物合成路径复杂，涉及多个中间体，不同生长阶段模块间通量平衡对细胞生长与产物合成至关重要。源自恶臭假单胞菌的转录调控因子CsiR和GcdR可响应细胞内戊二酸浓度，其转录调控系统在戊二酸生物合成动态调控中具应用潜力，但天然系统响应灵敏度与动态调控范围常无法满足代谢调控需求，需优化响应阈值和灵敏度。
基于计算机技术的蛋白质工程
蛋白质工程通过理性设计或定向进化修饰蛋白质分子，提升功能、稳定性或引入新特性。计算技术与人工智能推动蛋白质工程进入“设计-构建-测试-学习”（DBTL）闭环范式。计算机辅助蛋白质工程可大幅减少试错成本，加速设计周期。分子对接、分子动力学（MD）模拟可用于分析酶蛋白结构与构象变化，结合定点突变、易错PCR等技术构建关键酶突变体库。对于DavA、DavB等未解析结构的酶，可通过X射线晶体学、冷冻电镜分析结构，或利用AlphaFold 2、ESMFold等工具预测无模板蛋白结构，RFdiffusion、Chroma等生成模型设计蛋白支架。数据驱动与AI整合可借助Transformer模型等深度学习技术从大数据中建模序列-功能关系，计算机辅助定向进化可通过模拟所有可能单点突变筛选有益突变。
基于生物传感器的高通量筛选
生物传感器将特定代谢物浓度转化为荧光、比色或生长速率等可检测信号，实现高通量筛选。转录因子结合代谢物后激活调控启动子驱动报告基因表达，是经典生物传感器设计。戊二酸生物传感器由响应戊二酸的转录因子CsiR、其驱动的PG启动子和红色荧光蛋白mKate构成。恶臭假单胞菌中LysR家族蛋白GcdR通过调控戊二酰辅酶A脱氢路径关键基因gcdH和gcoT转录，亦具开发戊二酸生物传感器潜力。当前戊二酸生物传感器检测阈值约18 mM，需通过启动子工程调控RNA聚合酶结合效率或修饰转录因子结合位点数量、位置和亲和力扩展线性响应范围。流式细胞术、微流控芯片等现代技术可整合实现细胞荧光信号分选。
基于非粮底物的可持续生产
非粮发酵利用非食用生物质（如CO2、工业废物、木质纤维素、餐厨垃圾等）为碳源合成目标化学品，避免粮食资源竞争，降低原料成本，实现废物利用。通过异源表达降解和摄取蛋白，可扩展谷氨酸棒杆菌底物范围，提升L-赖氨酸从阿拉伯糖、木糖、甘油、纤维二糖、羧甲基纤维素等非粮底物的合成。但异源表达降解酶的工程菌难以达到工业级L-赖氨酸产量。木质纤维素作为最丰富生物质，是替代化石资源合成化学品、材料和燃料的潜在候选。通过适应性进化或代谢工程提升木质纤维素处理液转化率，可实现戊二酸环境友好型可持续合成，但需考虑底物收集、处理及产物分离纯化成本。
人工智能驱动数据整合与预测建模工具为蛋白质工程、高通量筛选、动态调控、组学分析等合成生物学方法注入新活力。代谢工程已从“试错”模式转向“数据驱动”精准设计。未来，人工智能、合成生物学与单细胞技术等新兴技术融合，将助力代谢工程实现更高效、经济绿色的生物制造，为绿色化学与可持续发展提供支撑。
结论
戊二酸作为重要C5平台化合物，在生物基材料、医药及化工领域应用前景广阔。代谢工程在戊二酸生物合成路径构建与优化方面取得显著进展。未来，人工智能辅助酶设计、高效生物传感器开发、动态调控与组学技术优化菌株及非粮底物发酵应用，将推动戊二酸生物合成向更高效、经济绿色的制造方式发展。本综述总结了戊二酸可持续生产方法，并对其生物合成提出展望。
