一种基于分裂DNA的新方法，用于激活CRISPR/Cas12a系统，实现无需扩增、双刺激响应的miRNA-221检测以及精确成像

《Talanta》：A new split DNA-based activation of CRISPR/Cas12a for amplification-free and dual-stimulus responsive detection and precise imaging of miRNA-221

CRISPR/Cas12a系统通过分DNA激活与APE1辅助实现miRNA-221的高灵敏度检测和精准成像，避免扩增步骤并降低假阳性。

　　

梁龙金|徐斌|肖世秀|穆晓梅|赵树林|田建鸟

中国教育部药用资源化学与分子工程重点实验室，广西药用资源化学与分子工程重点实验室，广西师范大学特色药用资源化学工程研究中心，化学与药学学院，桂林541004，中国

摘要

CRISPR/Cas12a系统是一种广泛应用于生物传感和分子诊断的基因编辑技术。然而，其核心组分的检测和调控仍然具有挑战性。因此，我们构建了一种新的基于分裂DNA的激活方法来调控CRISPR/Cas12a，并在此基础上开发了一种无需扩增和复杂设计的APE1辅助激活CRISPR/Cas12a系统，用于miRNA检测和精确成像。使用两条分裂DNA作为激活剂，并将其嵌入两个发夹结构中。当APE1和miRNA-221同时被引入时，DNA逻辑门被激活，从而释放决定性激活链，激活CRISPR/Cas12a系统的转剪切活性，使荧光探针信号显著增强。设计了不同的切割激活链发夹结构，并讨论了它们对CRISPR/Cas12a转剪切活性和激活效果的影响。该方法成功应用于检测细胞裂解物中的miRNA-221表达水平。miRNA-221的检测限为9.71 pmol/L（信噪比=3）。同时，该方法还可用于不同细胞内miRNA-221的精确成像，并能有效区分肿瘤细胞。本研究结合了分裂激活剂对CRISPR/Cas系统的调控与双响应DNA逻辑电路的优势。双响应激活设计有效减少了假阳性信号，提高了检测和成像的准确性。这种方法为利用分裂DNA激活CRISPR/Cas系统进行核酸检测和细胞成像提供了新的设计思路。

引言

CRISPR/Cas（规律间隔短回文重复序列相关Cas蛋白）系统是细菌和古菌中的适应性免疫系统[1]，[2]，用于抵御噬菌体和质粒等外源遗传物质的入侵。它是一种强大的基因编辑技术，在生物医学、农业和工业领域具有广泛的应用[3]，[4]。CRISPR/Cas12a（Cpf1）是CRISPR-Cas系统的一个成员，属于II类V型CRISPR-Cas系统[5]，[6]，[7]。CRISPR/Cas12a系统可以通过识别目标双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）被激活，激活的Cas12a可以对周围的ssDNA进行非特异性转剪切[8]，[9]，[10]，[11]。基于这一特性，它非常适用于核酸检测。脱氧核糖核酸（DNA）可以直接被CRISPR/Cas12a识别和检测，而对于类似miRNA的目标分子，则需要先进行逆转录成DNA，但这种检测方法通常不够灵敏，且需要核酸扩增，例如重组酶聚合酶扩增（RPA）[12]、链替换扩增[13]、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）[14]、滚环扩增（RCA）[15]和环介导等温扩增（LAMP）[16]。然而，由于CRISPR/Cas12a一旦被激活，会无差别地剪切周围的ssDNA，这可能导致核酸扩增模板降解，从而降低扩增效果[17]。因此，CRISPR/Cas12a的激活和核酸扩增不能同时进行，通常需要分阶段添加或逐步反应来完成，这会增加污染风险并延长反应时间。

为了解决上述问题，研究人员尝试通过控制crRNA的释放来调节Cas12a的活性，以减少CRISPR/Cas的背景泄漏并实现一步检测。例如，修改crRNA链中的光不稳定基团[18]，或使用与crRNA杂交的寡核苷酸链来阻断crRNA的识别[19]，[20]，[21]。这一过程需要优化crRNA上光不稳定基团的位置以及寡核苷酸链与crRNA的比例；不当的位置和比例会影响闭合效果。另一种策略是通过调整crRNA的结构来调节crRNA与Cas12a的结合活性。通过延长crRNA的5'端或3'端来闭合crRNA，从而抑制Cas12a的活性[22]，[23]，[24]，并通过目标分子释放crRNA作为开关来激活Cas12a以实现信号释放。但使用延长的RNA会导致复杂的二级结构形成和较高的合成成本。因此，迫切需要一种更简单、更通用的激活剂闭合方式，能够在目标暴露后迅速恢复CRISPR/Cas12a系统的功能，而无需对crRNA结构进行复杂和严格的修饰。

最近，罗某和耿某等人发现分裂DNA激活剂可以表现出协同效应[25]，[26]，[27]，通过分裂DNA的协同作用激活Cas12a的转剪切活性，从而实现高信号释放。孔某的研究小组发现了CRISPR/Cas12a的“RESET”效应，即当激活链形成完整的发夹结构时，会抑制其激活CRISPR/Cas12a系统的能力[28]，[29]。基于此，在本文中，我们设计了隐藏在两个发夹结构茎部的分裂CRISPR/Cas12a系统激活剂，目标miRNA的碱基互补配对使发夹结构打开，从而暴露出一半的激活链。另一半激活链通过APE1（Apurinic/apyrimidinnic内切酶1）的剪切作用被释放，释放出的两条分裂激活链可以特异性结合crRNA形成完整的激活链并激活CRISPR/Cas12a，从而快速实现信号释放。这种多刺激响应和分裂激活的CRISPR/Cas系统为精准诊断和成像研究领域的基因编辑系统提供了新的范例。

材料

本实验中的所有寡核苷酸链均通过高效液相色谱（HPLC）纯化。寡核苷酸链、一次性吸头、离心管、DEPC水和LbCas12a均购自上海桑工生物技术有限公司。MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A和HK-2细胞购自上海生物研究所。实验中使用的DNA链溶解在Tris-HCl中，浓度为100 μM；RNA链

原理设计

miRNA-221在多种肿瘤（如乳腺癌、肝癌和肺癌）中异常表达，其表达水平通常升高，通过检测miRNA-221的表达有助于肿瘤的早期诊断。本文中，miRNA-221被用作目标模型，设计了基于APE1的裂解DNA激活Cas12a的启动方法用于miRNA-221的表达分析，其原理如图1所示。根据miRNA-221的序列，我们设计了探针H₁、H₂

结论

在本研究中，我们构建了一种基于Cas12a的APE1辅助分裂DNA激活策略，并将其应用于miRNA-221的表达分析。利用发夹结构的稳定性，巧妙地将DNA激活链隐藏在发夹结构中，实现了对Cas12a的精确活性调控。这种双响应激活设计（AND逻辑门方法）减少了假阳性信号，从而提高了检测的准确性，该方法简单、快速且成本低

CRediT作者贡献声明

徐斌：验证、软件、资源。 梁龙金：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理、概念化。 田建鸟：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。 赵树林：撰写——审阅与编辑、监督。 穆晓梅：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。 肖世秀：可视化、验证、资源。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

竞争利益声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22564006）、广西自然科学基金（2025GXNSFBA069022）、广西研究生教育创新项目（XYCSR2024087）、广西师范大学八桂学者、广西大学青年科研能力提升项目（2024KY0061）的支持。