ctDNA是一种特殊的cfDNA，指的是由肿瘤细胞释放到血液中的DNA片段[1]。它反映了肿瘤的遗传特征，包括特定突变、拷贝数变异和表观遗传变化[2]。因此，ctDNA的检测为癌症的早期诊断、个性化医疗和治疗监测提供了重要的生物标志物。作为一种新兴的液体活检技术，ctDNA检测具有无创性和实时监测的优势，能够有效捕捉肿瘤的遗传异质性[1,2,3]。简单的血液检测可以评估患者的疾病状态、治疗反应并提供预后信息，使ctDNA成为癌症诊断和治疗中的有前景的工具[4,5]。
然而，ctDNA的检测也面临重大挑战。首先，野生型序列与突变型序列之间的相似性增加了假阳性的风险[1,6]。其次，与大量的野生型序列相比，突变型序列的丰度较低，尤其是在疾病早期阶段和耐药性突变出现时，使得检测更加困难[7,8]。最后，ctDNA片段的长度异质性很大，从几十个到几百个碱基对不等，这给PCR引物设计带来了复杂性[9]。这些特性要求使用高灵敏度和高特异性的方法来准确识别和量化ctDNA，同时尽量减少对片段长度的依赖。
目前，检测ctDNA的方法主要包括下一代测序（NGS）[10]、液滴数字PCR（ddPCR）[11]和扩增抵抗突变系统PCR（ARMS-PCR）[12,13]。NGS具有高通量能力，并能同时检测多种变异体[14]；然而，它在灵敏度方面存在挑战，特别是对于低频变异体，通常需要深度测序，这可能成本高昂且耗时[15]。对于特定突变的检测，更常用的是ddPCR[16]和ARMS-PCR[17]。ddPCR具有高灵敏度和定量准确性，但需要昂贵的专用设备，这些设备可能并不普及。ARMS-PCR效果良好且易于使用，但其灵敏度不足。在检测低丰度样本时，其性能可能不如深度测序或ddPCR[18,19]。此外，ddPCR和ARMS-PCR都需要针对特定长度的ctDNA设计引物，这限制了它们有效检测同一ctDNA中不同长度突变的能力。因此，迫切需要开发新的ctDNA检测方法，以实现高灵敏度、高特异性和便捷性。
为了提高基于PCR的ctDNA检测的信噪比，一种可行的方法是利用限制性内切酶选择性地降解野生型等位基因，从而富集突变型等位基因[20,21]。Pu等人[22]采用了两轮PCR策略结合间歇性限制性内切酶消化来检测cfDNA中的PIK3CA突变。然而，在PCR过程中保持酶活性具有挑战性，因为高温（约95°C）会迅速使大多数限制性内切酶失活——即使是最耐热的变体也会显著失去活性。这需要多次消化循环，但未完全消化的野生型DNA在后续PCR循环中可能会呈指数级扩增。此外，多轮PCR增加了气溶胶污染的风险，提高了假阳性率。
最近在等温扩增技术方面的进展，如环介导等温扩增（LAMP）[23]、重组酶聚合酶扩增（RPA）[24]、滚环扩增（RCA）[25]和杂交链反应（HCR）[26]，在ctDNA检测方面显示出潜力。其中，LAMP和RPA因其强大的扩增能力而被广泛采用。设计针对突变的引物可以提高区分度，但这在技术上仍然具有挑战性，通常需要辅助方法[23,27]。为了将基于限制性内切酶的富集与等温扩增相结合，我们评估了多种平台，并选择了RPA，因为它在37~42°C的温度下仍能保持酶活性——远低于LAMP所需的60~65°C，后者会损害大多数酶的功能。
因此，本研究开发了一种限制性内切酶辅助重组酶聚合酶扩增（REA-RPA）方法。基于REA-RPA，我们开发了两种创新方法：一体式实时荧光检测用于特异性检测突变片段，以及无需引物的基因型转换方法以适应片段异质性的ctDNA。REA-RPA的核心机制是利用限制性内切酶的序列特异性识别特性，解决突变型与野生型序列之间的高度同源性问题，从而在等温扩增系统中实现野生型等位基因的持续降解。这一过程不仅降低了假阳性的风险，提高了检测特异性，还增强了目标信号并提高了检测灵敏度。通过采用一体式实时荧光REA-RPA方法结合基因分型探针，我们实现了对低至0.01%突变丰度样本的准确检测。对于无需引物的基因型转换策略，野生型序列的降解产物作为内源性引物使用。以突变型序列为模板，大肠杆菌 DNA聚合酶I介导引物延伸，逐渐将野生型等位基因转化为突变形式。这种设计克服了传统方法中引物设计的限制，能够同时检测不同长度ctDNA片段中的相同突变。这些特性使得基于REA-RPA的方法适用于检测低丰度、长度异质性的ctDNA突变。通过这种方法，我们成功地在血液样本中检测到了ctDNA。
