《Toxicology Letters》：Transcript-protein discrepancy of glutamatergic receptor subunits in human iPSC-derived neurons: implications for neurotoxicity testing
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本研究针对hiPSC来源神经元模型在模拟成熟谷氨酸能突触方面的局限性，系统评估了NMDA与AMPA受体亚基的转录和蛋白表达动态。结果发现关键亚基（如GluN2A、GluN3A）存在显著的转录-蛋白表达脱节，且缺乏典型的GluN2B/GluN2A发育性转换，提示模型在测试时间窗内未达到完全功能成熟。研究强调需结合蛋白水平验证以提升hiPSC模型在神经毒性评估中的可靠性，为优化体外神经模型提供了分子依据。
在神经科学和毒理学研究领域，减少动物实验并推动人类相关体外模型的发展已成为重要趋势。人类诱导多能干细胞（hiPSC）分化的神经元模型为此带来了巨大希望，但在精确再现某些复杂的神经发育过程，如突触发生和成熟方面，仍面临挑战。目前，研究复杂的突触过程，如突触棘的结构和功能复杂化，仍然主要依赖啮齿类动物原代神经元培养物，这被视为“金标准”。其中一个关键机制是谷氨酸能突触成熟过程中的GluN2B/GluN2A亚基转换，它促进α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体的募集。然而，hiPSC来源神经元中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）和AMPA受体的表达和成熟动态，尤其是在转录本和蛋白质水平是否一致，仍然缺乏系统表征。这直接影响到此类模型在神经毒性测试，特别是NMDA受体介导的兴奋性毒性研究中的可靠性。
为了填补这一空白，研究人员开展了一项主题研究，旨在详细表征由人神经前体细胞（hNPC）分化的神经元模型中谷氨酸能系统的发育情况。研究团队采用了来自商业来源的hiPSC，并通过单层神经诱导程序将其分化为神经前体细胞（NPC），随后在特定的培养基中进一步分化为神经元，培养时间点包括0、5、15、30和60天体外培养（DIV）。
为开展研究，作者主要应用了几项关键技术方法：通过免疫荧光染色和定量分析（如SOX1/SOX2与DAPI共定位分析）监测神经前体细胞标志物（NES, PAX6, SOX1, SOX2）和神经元标志物（MAP2, β-III-tubulin）的表达变化，以评估分化效率；利用实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测NMDA受体亚基（GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, GRIN2C, GRIN2D, GRIN3A）和AMPA受体亚基（GRIA1, GRIA2, GRIA3, GRIA4）的mRNA表达水平；通过蛋白质印迹（Western Blot）分析相应受体亚基（GluN1, GluN2A, GluN2B, GluN2C, GluN2D, GluN3A, GluA1, GluA2, GluA3, GluA4）的蛋白丰度；并使用免疫荧光染色观察突触前标记物突触素（Synaptophysin）和突触后标记物PSD95的分布，以评估突触组织情况。
hNPCs分化
研究通过分析神经前体细胞标志物（Nestin, SOX1, SOX2, PAX6）和神经元标志物（MAP2, β-III-tubulin）的表达，证实了分化协议的成功。前体细胞标志物的mRNA和蛋白水平在30和60 DIV时显著下调，而神经元标志物的表达则随时间增加。同时，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达在60 DIV时增加，表明培养物中存在星形胶质细胞。
NMDA和AMPA受体主要亚基的转录水平
在30 DIV时，与0 DIV的NPCs相比，多个NMDA受体亚基（GRIN2A, GRIN2B, GRIN2D, GRIN3A）的mRNA水平显著升高，GRIN1呈上升趋势但未达显著性，GRIN2C无显著变化。对于AMPA受体亚基，GRIA2和GRIA4的mRNA水平在30 DIV时升高，而GRIA1和GRIA3无显著变化。
NMDA和AMPA受体主要亚基的蛋白丰度
在蛋白水平上，出现了与转录水平不一致的模式。GluN2B蛋白在30和60 DIV时显著增加，而GluN2A蛋白虽其mRNA增加，但蛋白水平与NPCs相比无差异，且呈下降趋势。GluN3A的mRNA在30 DIV时增加，但其蛋白丰度在30和60 DIV时显著降低。对于AMPA受体亚基，GluA3和GluA4蛋白在特定时间点（分别为60 DIV和30 DIV）增加，GluA1呈增加趋势，而GluA2在30 DIV有增加趋势但在60 DIV回落至接近NPCs水平。突触标记物（Synaptophysin/PSD95）的免疫荧光显示弥漫性染色，缺乏典型的点状突触接触模式。
研究结论指出，尽管hiPSC来源的神经元模型能够成功分化为表达神经元标志物的细胞，但在测试的时间框架内（最多60 DIV），其谷氨酸能受体系统并未达到完全成熟状态。最关键的发现在于关键NMDA和AMPA受体亚基存在显著的转录本与蛋白质表达水平脱节，特别是未能观察到发育中典型的GluN2B向Glu2A亚基的转换（GluN2B/GluN2A switch），以及GluN3A蛋白的异常低表达。同时，突触标记物未形成点状分布，提示突触成熟不完全。这些分子层面的不成熟特征表明，当前的模型可能不完全适用于模拟依赖于成熟NMDA受体功能的过程，如兴奋性毒性。讨论部分强调，这一发现对神经毒性测试具有重要意义，它警示研究者不能仅依赖转录组数据评估模型成熟度，必须整合蛋白质水平验证。研究的意义在于明确了优化hiPSC衍生神经元模型的方向，例如延长培养时间、添加成熟诱导信号（如与星形胶质细胞共培养），以期更好地模拟体内受体动力学，从而提高其在风险评估和新药安全评价中的可靠性和预测价值。这项工作强调了在推动动物实验替代方法（NAMs）的背景下，对体外模型进行严格功能验证的必要性。
